張學通 張博學 林媛媛

摘 要：選取3種草地早熟禾（Poa pratensis L.）為試驗材料，以成熟并且飽滿的種子為外植體，在MS基礎培養(yǎng)基上添加不同種類和濃度植物激素，篩選適宜草地早熟禾愈傷組織的誘導方法，為建立其高效的再生體系奠定基礎。結果表明，“如意”最佳的初代和繼代愈傷培養(yǎng)基為MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA;“藍之夢”最佳的初代和繼代愈傷培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D;“優(yōu)美”最佳的初代愈傷培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D，其最佳的繼代培養(yǎng)基為MS加2.0mg/L2，4-D。

關鍵詞：草地早熟禾;愈傷組織;組織培養(yǎng);植物激素

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430001

草地早熟禾（Poa pratensis L.）為禾本科早熟禾屬，是一種優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草，其優(yōu)點包括耐冷、綠期較長、根系發(fā)達、葉色濃綠、抗性較好，在城市園林綠化、改善環(huán)境等方面被廣泛利用[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，草地早熟禾屬于多倍體植物，并且為無融合生殖方式，構建成熟的再生體系是基因育種的重要手段之一[3]。植物生長調(diào)節(jié)劑對于不同植物的愈傷組織誘導有較大差異，不同激素種類及激素濃度配比直接影響其再生體系的構建。本研究選擇3種抗旱性較強的草地早熟禾品種，研究不同激素種類和濃度對于其愈傷組織誘導情況的差異，篩選適宜的初愈培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基，為后續(xù)完整再生體系的構建提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取的供試材料為3個草地早熟禾品種，分別是“如意”、“藍之夢”、“優(yōu)美”，均購于北京正道生態(tài)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒

本研究選擇成熟并且飽滿供試草地早熟禾種子，用自來水沖洗種子1h，用無菌水沖洗3次，浸泡于無菌水30min。在無菌環(huán)境中進行消毒，消毒方式分為4種：75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒5min，無菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無菌濾紙;75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒10min，無菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無菌濾紙;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒5min，無菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無菌濾紙;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒10min，無菌水沖洗5～6遍，之后將種子置于無菌濾紙。統(tǒng)計7d的污染率，21d的褐化率。

1.2.2 草地早熟禾種子愈傷組織的誘導

將消毒后的種子接種于基本MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基瓊脂濃度為10g/L，蔗糖濃度為30g/L，不同激素組合方式見表1。每個培養(yǎng)瓶接種10～20粒種子，每個處理接種20瓶。將培養(yǎng)瓶置于25℃黑暗培養(yǎng)，每7d記錄各處理的出愈率及生長狀態(tài)，28d之后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。將生長良好的愈傷組織接種到新配置的繼代培養(yǎng)基中，42d之后觀察并統(tǒng)計愈傷組織繼代培養(yǎng)的情況。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用統(tǒng)計分析軟件SPSS22.0對誘導率相關數(shù)據(jù)進行分析;采用Graphpad prism 8.0進行圖形的制作。

2 結果與分析

2.1 消毒方式對外植體染菌率和褐化率的影響

由圖1可知，乙醇、NaClO溶液消毒時間對草地早熟禾種子的污染率和褐化率均有影響。消毒方式4（75%乙醇60s加1%NaClO 10min）的污染率最低，其次是消毒方式2（75%乙醇30s加1% NaClO 10min）（見圖1-A）。綜合4種消毒方式的污染率，發(fā)現(xiàn)隨著NaClO消毒時間的減少，污染率明顯提升。4種消毒方式對愈傷組織褐化率的影響排序為1<2<3<4，結果發(fā)現(xiàn)消毒時間越長，褐化率越高。

2.2 不同激素對草地早熟禾初代愈傷組織誘導的影響

由圖2可以看出，草地早熟禾因品種不同，其2，4-D與6-BA激素組合誘導的出愈率也存在一定差異。在N-5（MS加1.0mg/L 2，4-D加0.1mg/L6-BA）培養(yǎng)基中，草地早熟禾“如意”的出愈率最高，其次是N-3（MS加3.0mg/L2，4-D）的誘導培養(yǎng)率較高。這與“藍之夢”的誘導結果差異較大，“藍之夢”在N-2（MS加2.0mg/L2，4-D）和N-3培養(yǎng)基中出愈率最高，而其它組培養(yǎng)的出愈率較低。草地早熟禾“優(yōu)美”僅在N-3培養(yǎng)基中出愈率最高，其它組出愈率較低。綜合N1、N2、N3、N4的數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)3種草地早熟禾種子的出愈率均隨著2，4-D濃度的增加逐漸增多，但2，4-D增加為4mg/L時，出愈率被顯著抑制。綜合N5、N6、N7、N8的數(shù)據(jù)，僅“如意”在N5培養(yǎng)基誘導下出愈率較高，“藍之夢”、“優(yōu)美”的4種培養(yǎng)基的出愈率均較低。對比N1～N8的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，2.0～3.0mg/L2，4-D誘導的出愈率較高，而2，4-D與6-BA混合培養(yǎng)基大部分抑制了愈傷組織的出愈率。

2.3 不同激素對草地早熟禾繼代愈傷組織誘導的影響

將初代培養(yǎng)基誘導得到的愈傷組織，接種到對應的繼代培養(yǎng)基中（見表2）。結果發(fā)現(xiàn)，“如意”在2種不同的繼代培養(yǎng)基中，增值倍數(shù)均超過2.32，其中MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA的增值得到的愈傷組織的質(zhì)量更好，呈淡黃色，多數(shù)愈傷呈顆粒感?！八{之夢”在MS加3.0mg/L2，4-D的培養(yǎng)中增值狀況最好，增值率高，且愈傷質(zhì)量良好?！皟?yōu)美”在MS加2.0mg/L2，4-D繼代培養(yǎng)中不僅增值倍數(shù)較高，而且生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)淡黃色的顆粒感。綜上結果，“如意”最佳的繼代培養(yǎng)基為MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA，“藍之夢”的最佳繼代培養(yǎng)基為MS加3.0mg/L2，4-D，“優(yōu)美”的最佳繼代培養(yǎng)基為MS加2.0mg/L2，4-D。