范三紅，李穎星，白寶清

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)特色植物資源研究與利用山西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

清香型白酒獨(dú)特的固態(tài)多微釀造及固態(tài)蒸餾工藝賦予了其豐富的呈香呈味物質(zhì)和生物活性成分[1-2]。高級(jí)醇[3]是白酒中重要的呈香物質(zhì)，主要由釀酒酵母在釀造的主發(fā)酵時(shí)間段生成，它能夠增加白酒的協(xié)調(diào)感和飽滿感，賦予白酒特殊的香氣，給人愉悅的感覺(jué)，若濃度過(guò)高，則有令人不快的雜異味，并且飲用后容易“上頭”，危害人體的健康[4]。正丙醇、2-甲基-1-丙醇（異丁醇）、3-甲基-1-丁醇（異戊醇）和β-苯乙醇占白酒高級(jí)醇總量的70%～80%[5]。

一般測(cè)定酒類中揮發(fā)性香氣成分的方法是基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）來(lái)實(shí)現(xiàn)[6-8]。孫嘯濤等[1]采用渦旋輔助液液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)67種白酒中四甲基吡嗪等物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)；吳繼源[8]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒中乙酸乙酯含量；趙東瑞等[9-10]應(yīng)用固相微萃取法、液液萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析手段對(duì)芝麻香型白酒中含硫化合物進(jìn)行定性分析。

目前關(guān)于白酒中高級(jí)醇的文獻(xiàn)較少，由于白酒中的高級(jí)醇的含量很低，因此在色譜測(cè)定之前需要對(duì)其進(jìn)行萃取和濃縮處理[10-13]。張倩等[14]應(yīng)用液液萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用儀分析2種芝麻香型白酒中香氣活性成分；倪偉等[6]采用分散液液微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用的方法檢測(cè)了幾種市售葡萄酒中的主要高級(jí)醇；李建民等[15]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用研究酒醅中該酵母麩曲的不同添加比例對(duì)陶融型原酒中高級(jí)醇含量的影響；張雪雪等[16]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法對(duì)二鍋頭等酒中甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇等物質(zhì)進(jìn)行了定量；唐暉慧等[17]采用分散液液微萃取結(jié)合氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器法測(cè)定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇的含量。

本實(shí)驗(yàn)建立了渦旋輔助分散液液微萃取-氣相色譜法（dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography，DLLME-GC）測(cè)定清香型白酒中高級(jí)醇的方法，對(duì)白酒樣中分散液液微萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化[18]，并測(cè)定其在6種不同酒精度清香型白酒中的含量，以期為研究清香型白酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種市售清香型白酒酒樣（編號(hào)為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6）：（酒精度分別為18%vol、42%vol、42%vol、53%vol、53%vol、53%vol）；正丙醇（純度99.7%）、異丁醇（純度99.0%）、異戊醇（純度99.0%）、2,3-丁二醇（純度98.0%）、β-苯乙醇（純度99.0%）、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯乙烯、二氯甲烷、溴苯（均為分析純）：北京百靈威科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；Vortex-6渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TG16A-W高速離心機(jī)：上海金鵬分析儀器有限公司；PB-10酸度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬酒樣、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

模擬酒樣：準(zhǔn)確移取900 μL正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇，200 μLβ-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用體積分?jǐn)?shù)為15%的乙醇溶液定容至500 mL，配制模擬酒樣。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取100 μL正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，20 μLβ-苯乙醇溶液于容量瓶中，分別用體積分?jǐn)?shù)為15%的乙醇溶液定容至100 mL，使正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇體積分?jǐn)?shù)為0.1%，β-苯乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.02%，4 ℃冰箱存儲(chǔ)備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液用體積分?jǐn)?shù)為15%的乙醇溶液逐級(jí)稀釋，得到正丙醇、異丁醇質(zhì)量濃度為1.00～40.00 mg/L、異戊醇質(zhì)量濃度為1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇質(zhì)量濃度為1.25～50.00 mg/L、β-苯乙醇質(zhì)量濃度為0.25～10.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 酒樣前處理

將100 μL分散劑、60 μL萃取劑置于1.5 mL離心管中混合均勻。用微量注射器將混合有機(jī)相快速注入1 100 μL置于1.5 mL離心管的模擬酒樣中。旋渦振蕩器振30 s，7 000 r/min離心4 min。將下層有機(jī)相吸出，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以正丙醇的測(cè)定峰面積（Y）為響應(yīng)值，從萃取劑體積（X1）、分散劑體積（X2）、萃取時(shí)間（X3）、酒精度（X4）、NaCl質(zhì)量濃度（X5）、pH值（X6）中篩選出影響分散液液微萃取效率顯著的因素[20-21]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取時(shí)間（A）、NaCl質(zhì)量濃度（B）、分散劑體積（C）3個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 氣相色譜條件

色譜柱：SGEAC-20毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純度氮?dú)猓∟2），流速1.10 mL/min；分流比10∶1，進(jìn)樣量1μL，尾吹氣30mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃，升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，總分析時(shí)間43 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 分散液液微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 酒樣酒精度的選擇

由于試驗(yàn)中萃取劑的用量比較少，市售白酒酒樣的酒精度普遍較高，導(dǎo)致萃取溶劑在酒樣中有一定溶解，并且隨酒精度的增加溶解量也明顯增加，當(dāng)酒精度＞50%vol時(shí)，萃取劑與酒樣完全互溶。考察酒精度分別為5%vol、10%vol、15%vol、20%vol對(duì)分散液液微萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同酒精度對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.1 Effect of different alcohol contents on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖1可知，正丙醇的萃取效率在各個(gè)酒精度下沒(méi)有明顯變化；當(dāng)酒精度在5%vol～15%vol時(shí)，異丁醇、異戊醇和β-苯乙醇萃取效率明顯增加；當(dāng)酒精度在15%vol～20%vol時(shí)，β-苯乙醇萃取效率顯著降低，異丁醇和異戊醇的萃取效率也有所下降；2,3-丁二醇萃取效率遠(yuǎn)小于其余的醇類；當(dāng)酒精度增加至20%vol時(shí)，2,3-丁二醇萃取效率無(wú)明顯提高。因此，選擇酒樣的酒精度為15%vol。

2.1.2 酒樣pH值的選擇

考察pH值分別3.5、4.5、5.5、6.5、7.5對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同pH值對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.2 Effect of different pH values on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖2可知，當(dāng)pH值為3.5時(shí)，正丙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇的萃取效果較差，異丁醇和異戊醇有一定的富集效果；當(dāng)pH值在3.5～5.5時(shí)，正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率有顯著增加；當(dāng)pH值在5.5～7.5時(shí)，異丁醇、異戊醇萃取效率顯著減少，正丙醇和β-苯乙醇的萃取效率也有所下降，2,3-丁二醇無(wú)明顯變化。因此，選擇酒樣的pH值為5.5。

2.1.3 萃取劑的選擇

萃取溶劑在萃取過(guò)程中有非常重要的作用，直接影響著對(duì)目標(biāo)物的萃取效率[5]。分別考察二氯甲烷、三氯乙烯、四氯乙烯、溴苯和三氯甲烷對(duì)分散液液微萃取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同萃取劑對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.3 Effect of different extractants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖3可知，四氯乙烯和溴苯對(duì)5種高級(jí)醇的萃取效果都比較差，二氯甲烷作為萃取劑對(duì)5種高級(jí)醇的萃取效率均最高。因此，選擇二氯甲烷為萃取溶劑。

2.1.4 萃取劑體積的選擇

考察二氯甲烷體積分別為40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同萃取劑體積對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.4 Effect of different extractant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖4可知，當(dāng)二氯甲烷體積為40～50 μL時(shí)，5種高級(jí)醇萃取率都很低；當(dāng)二氯甲烷體積為60 μL時(shí)，正丙醇、異戊醇、β-苯乙醇萃取效率顯著增加，異丁醇和2,3-丁二醇的萃取率也有所增加；當(dāng)二氯甲烷體積＞60 μL時(shí)，5種高級(jí)醇萃取效率都明顯變小。因此，選擇萃取劑體積為60 μL。

2.1.5 分散劑的選擇

合適的分散劑有助于目標(biāo)化合物的萃取和濃縮?？疾旆稚┮译?、丙酮、乙酸乙酯、甲醇對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同分散劑對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.5 Effect of different dispersants on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖5可知，綜合5種醇的萃取情況，丙酮作為分散劑的萃取效率更好。因此，選擇丙酮作為分散劑。

2.1.6 分散劑體積的選擇

考察分散劑體積分別為40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同分散劑體積對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.6 Effect of different dispersant volumes on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖6可知，當(dāng)分散溶劑體積在40～100 μL時(shí)，正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率顯著增加；當(dāng)分散劑體積＞100 μL時(shí)，異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇的萃取效率降低，正丙醇萃取效果無(wú)明顯變化，2,3-丁二醇萃取情況無(wú)明顯差異。因此，分散劑體積選擇100 μL。

2.1.7 NaCl質(zhì)量濃度的選擇

鹽的加入可以改變水溶液的離子強(qiáng)度和溶質(zhì)的溶解度，考察NaCl溶液質(zhì)量濃度分別為0、0.04 g/mL、0.07 g/mL、0.10 g/mL、0.13 g/mL、0.16 g/mL、0.19 g/mL對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同NaCl質(zhì)量濃度對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.7 Effect of different NaCl mass concentrations on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

由圖7可知，5種高級(jí)醇的萃取效率在質(zhì)量濃度為0.19 g/mL時(shí)最高。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.21 g/mL時(shí)離心管底部有NaCl固體不溶物，溶液達(dá)到飽和。因此，鹽濃度選擇0.19g/mL。

2.1.8 萃取時(shí)間的選擇

考察萃取時(shí)間分別為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s對(duì)分散液液微萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，異戊醇和β-苯乙醇在萃取時(shí)間為30 s時(shí)萃取效果最好；異丁醇在萃取時(shí)間為20 s時(shí)萃取效率最高，但與萃取時(shí)間為30 s時(shí)萃取效果沒(méi)有顯著差異；當(dāng)萃取時(shí)間＞30 s時(shí)，正丙醇、2,3-丁二醇萃取效率沒(méi)有顯著變化。因此，萃取時(shí)間選擇30 s。

圖8 不同萃取時(shí)間對(duì)分散液液微萃取效率的影響Fig.8 Effects of different extraction time on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以正丙醇的峰面積（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素設(shè)計(jì)了高（1）、低（-1）2個(gè)水平，對(duì)萃取劑體積（X1）、分散劑體積（X2）、萃取時(shí)間（X3）、酒精度（X4）、NaCl質(zhì)量濃度（X5）、pH值（X6）進(jìn)行顯著性考察。隨機(jī)選擇正丙醇為例以闡明其過(guò)程和結(jié)果分析，結(jié)果見(jiàn)表1，Plackett-Burman試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析見(jiàn)表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表2可知，萃取劑體積、萃取時(shí)間兩個(gè)因素影響顯著（P＜0.05），NaCl質(zhì)量濃度因素P=0.077 4，影響也較大，因此確定出對(duì)分散液液微萃取效果影響最顯著的因素為萃取劑體積、萃取時(shí)間和NaCl質(zhì)量濃度，選取這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。分散劑體積、酒精度和pH值選取單因素試驗(yàn)最優(yōu)水平，即分散劑體積100 μL、酒精度15%vol、pH值5.5。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素效應(yīng)分析Table 2 Main effects analysis of each factors of Plackett-Burman experiments

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取萃取劑體積（A）、NaCl質(zhì)量濃度（B）和萃取時(shí)間（C）為自變量，正丙醇的測(cè)定峰面積（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。正丙醇基于響應(yīng)值與變量繪制的二次回歸模型如下[19-20]：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

使用相同的方法，根據(jù)響應(yīng)值與變量的關(guān)系，繪制其余四種高級(jí)醇的二次回歸模型如下：

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型的P值＜0.001，表明試驗(yàn)誤差很小，模型具有較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，適用于數(shù)據(jù)分析；失擬項(xiàng)P值=0.530 4＞0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明試驗(yàn)誤差對(duì)模型沒(méi)有顯著影響。回歸方程總決定系數(shù)R2=0.9980，表明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度較好，可用該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。方差分析的結(jié)果也顯示了一次項(xiàng)A、B和C，交互項(xiàng)AB和BC以及二次項(xiàng)A2、B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）?；貧w模型可以反映正丙醇的測(cè)定峰面積與萃取劑體積，NaCl質(zhì)量濃度和萃取時(shí)間之間的關(guān)系。

由Design Expert 8.0.6軟件繪制各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，萃取劑體積50～70 μL、NaCl質(zhì)量濃度0.18～0.20 g/mL范圍內(nèi)，萃取率先增大后減?。惠腿w積50～70 μL、萃取時(shí)間20～40 min范圍內(nèi)，分散液液微萃取率先增大后減?。籒aCl質(zhì)量濃度0.18～0.20 g/mL、萃取時(shí)間20～40 min時(shí)，分散液液微萃取率先增大后減小。通過(guò)對(duì)回歸模型的分析，可以確定分散液液微萃取的最佳條件為萃取劑二氯甲烷60 μL、NaCl質(zhì)量濃度0.19 g/mL、萃取時(shí)間30 s。在此最佳萃取條件下，正丙醇的測(cè)定峰面積為7.399×108。

圖9 各因素對(duì)分散液液萃取效率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on efficiency of dispersion liquid-liquid microextraction

2.4 清香型白酒中高級(jí)醇檢測(cè)方法驗(yàn)證

2.4.1 檢出限、定量限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察結(jié)果

清香型白酒中5種高級(jí)醇線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程方程、線性相關(guān)系數(shù)（R2）、檢測(cè)限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）。線性相關(guān)系數(shù)（R2）在線性范圍內(nèi)都＞0.99，線性關(guān)系良好。將信噪比＞3確定為檢出限，信噪比＞10確定為定量限；檢出限（LOD）范圍為0.01～0.03 mg/L，定量限（LOQ）范圍為0.05～0.10 mg/L。

表5 5種高級(jí)醇的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 5 Linear regression equations,linear ranges,coefficients,detection limit and quantitation limit of 5 higher alcohols

2.4.2 精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

以市售清香型白酒Y-1為加標(biāo)樣品，用蒸餾水稀釋至酒精度為15%vol。依照上述確定的最佳萃取條件，用模擬酒分別制備10 mg/L、30 mg/L、60 mg/L的正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照酒樣前處理方法處理，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每個(gè)濃度進(jìn)樣5針，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5），結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，日內(nèi)、日間精密度結(jié)果的RSD分別＜7%、＜8%，表明該檢測(cè)方法精密度良好。加標(biāo)回收率在83.1%～108.3%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高。

表6 方法的精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of precision and standard recovery rate tests of method

續(xù)表

2.5 實(shí)際酒樣檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)從市場(chǎng)購(gòu)買的6種不同品牌的清香型白酒（用蒸餾水稀釋至酒精度為15%vol中正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量進(jìn)行檢測(cè)。6種白酒的正丙醇、異丁醇、異戊醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇的含量分別為0.064～0.116 g/L、0.057～0.127 g/L、0.262～0.450 g/L、0.017～0.035 g/L和0.008～0.012 g/L。

表7 6種清香型白酒中5種高級(jí)醇含量的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Determination results of 5 higher alcohols contents in 6 light-flavor Baijiu samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于DLLME與GC聯(lián)用分析清香型白酒中主要高級(jí)醇的新型分析方法。結(jié)果表明，6種白酒中的正丙醇和異丁醇在質(zhì)量濃度為1.00～40.00 mg/L、異戊醇在質(zhì)量濃度為1.00～150.00 mg/L、2,3-丁二醇在質(zhì)量濃度為1.25～50.00 mg/L和β-苯乙醇在質(zhì)量濃度為0.25～10.00 mg/L的范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系（R2＞0.99）；檢出限為0.01～0.03 mg/L，定量限為0.05～0.10 mg/L。日內(nèi)、日間精密度結(jié)果的RSD分別＜7%、＜8%，表明該檢測(cè)方法精密度良好；加標(biāo)回收率在83.1%～108.3%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高。

對(duì)6種白酒分析表明，所有酒樣中均含有5種高級(jí)醇，正丙醇含量范圍為0.064～0.116 g/L，異丁醇含量范圍為0.057～0.127 g/L，異戊醇含量范圍為0.262～0.450 g/L，2,3-丁二醇含量范圍為0.017～0.035 g/L、β-苯乙醇含量范圍為0.008～0.012 g/L。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、低成本和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足實(shí)踐中生產(chǎn)工藝的控制和成品質(zhì)量檢驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)的需要。