史默怡 韓宇博 劉莉

益氣溫陽活血利水方為筆者團隊治療慢性心衰的經驗用方，此方法在改善患者中醫(yī)癥候、心臟功能、臨床癥狀方面具有很好療效[1]。前期研究已經證明此方可以改善去甲腎上腺素致H9c2心肌細胞損傷和阿霉素致大鼠心衰模型心肌能量代謝[2-3]，為進一步探究機理，在前期基礎上，本課題選用大鼠H9c2心肌細胞為實驗對象，觀察益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導心肌細胞凋亡以及對線粒體凋亡途徑相關基因及蛋白的表達影響，為該藥的臨床應用提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及動物

H9c2大鼠心肌細胞來源于上海中科院細胞庫；雄性SD大鼠45只，體重(200±20)g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(黑)2015006，普通飼料喂養(yǎng)，適應環(huán)境2周后進入實驗狀態(tài)。

1.2 實驗藥物

益氣溫陽活血利水方：白人參20 g、黃芪20 g、桂枝10 g、丹參15 g、白術15 g、茯苓20 g、葶藶子15 g、益母草15 g、淫羊藿20 g、仙鶴草30 g、甘草10 g，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中藥局。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡(上海麥尚科學儀器有限公司)；酶標儀(上海申勝生物技術有限公司)；高速低溫離心機(德國Sartorius公司)；-80℃超低溫冰箱(中國海爾)；96孔板(美國Bio-Rad公司)?？ㄍ衅绽煞?1 g)(SIGMA，產地美國，分子量：217)。

1.4 主要試劑

Real-time PCR試劑盒(上海 Novland Co.Ltd )；血管緊張素II干粉(5 mg，SIGMA，產地美國，分子量：1046)1 mg溶解于10 mL PBS制成濃度為1×10-4mol/L的儲存液，使用時1：100稀釋，造模濃度為1×10-6mol/L，微孔濾膜濾過，分裝，避光-20℃保存。卡托普利干粉(1 g，SIGMA，產地美國，分子量：217)0.217 mg溶于10 mL PBS溶液，使用時1：10稀釋，有效濃度為1×10-5mol/L，微孔濾膜濾過，分裝，避光-20℃保存。

1.5 中藥湯劑制備

方劑中所有中藥在蒸餾水浸泡2小時，操作時白人參切片，葶藶子包煎，煎煮2次，每次煮沸后再煎煮30分鐘，紗布濾過，兩次藥液合并，水浴濃縮成每毫升含6 g生藥的藥液。

1.6 含藥血清制備

45只SD大鼠用隨機數(shù)字方法分為空白對照組15只，中藥方組30只，灌胃前禁食12小時，空白對照組每日灌服與中藥方組等體積生理鹽水，中藥方組每日灌服34.2 g生藥(5.7 mL/200 g大鼠，劑量按70 kg人與200 g大鼠體表面積等效劑量的10倍灌胃)，每日2次，連續(xù)給藥3天，于末次灌胃1～2小時內無菌條件下眼動脈采血，3000 r/min離心15分鐘分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56℃滅活30分鐘，分裝標示后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 細胞培養(yǎng)

H9c2細胞置于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將接種好的培養(yǎng)瓶瓶口旋松置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)情況每1～2天更換培養(yǎng)液，當細胞鏡下觀察約至瓶底80%以上時傳代。傳代時用PBS清洗加入1 mL 0.25%胰酶消化細胞，培養(yǎng)瓶長軸輕輕搖晃使之覆蓋全細胞表面，約1分鐘時間，當肉眼觀察瓶體內液體出現(xiàn)流沙樣改變或顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞變圓、細胞間隙變大、細胞脫落瓶底時立即加入1 mL完全培養(yǎng)液，終止消化，用吸管吹打，使細胞從瓶壁脫落，并且形成細胞懸液，1000 r/min離心5分鐘，棄上清。用1 mL培養(yǎng)液將細胞混勻，細胞計數(shù)。

1.8 細胞分組及給藥方法

實驗分為6組。含藥血清預處理4小時后加入AngII，使最終AngII濃度為1×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72小時誘導細胞凋亡模型。空白血清對照組：DMEM+8%空白血清；模型組：DMEM+8%空白血清+ AngⅡ；含藥血清高劑量組：DMEM+8%含藥血清+AngⅡ；含藥血清中劑量組：DMEM+4%含藥血清+4%空白血清+AngⅡ；含藥血清低劑量組：DMEM+2%含藥血清+2%空白血清+AngⅡ；卡托普利組：DMEM+8%空白血清+卡托普利(1×10-5mol/L)+ AngⅡ。

1.9 MTT法檢測H9c2心肌細胞增殖活性

收集處于對數(shù)生長期細胞狀態(tài)良好的H9c2心肌細胞，胰酶消化，離心，重懸，細胞計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調整細胞數(shù)量，以每孔5×103個細胞數(shù)目接種于96板孔中，每孔培養(yǎng)基液體為100 μL，置于培養(yǎng)箱中，細胞生長至平底約80%時，棄去液體，加入不含血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時，使細胞處于饑餓。含藥血清干預，細胞分為6組，每組5個復孔，藥物提前預處理4小時后加入AngII，使最終AngII濃度為1×10-6mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后每實驗孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4小時。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，避光，振蕩搖勻10分鐘，使結晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫儀器上測OD(opticol density，OD)值，每組重復3次，記錄結果，計算細胞增殖率，增殖率(%)=實驗組OD值/正常組OD值×100%。

1.10 羅丹明123測H9c2心肌細胞線粒體膜電位

離心后的細胞重懸于培養(yǎng)基中，加入Rho123熒光染液0.5 μg/mL，放置在細胞培養(yǎng)箱中孵育10分鐘，PBS洗滌細胞2次，重新重懸細胞于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60分鐘。取100 μL細胞混合液涂于載玻片上，熒光顯微鏡觀察，激發(fā)濾光片波長488 nm，阻斷濾光片波長515 nm，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.11 免疫組化檢測H9c2細胞Bcl-2、Bax的表達

細胞造模，細胞爬片采用10%福爾馬林固定20分鐘，PBS沖洗2次，每次2分鐘；SABC染色法進行細胞染色，每組細胞爬片滴加3%H202，室溫下10分鐘，PBS洗滌3次。滴加5%BSA封閉液，室溫下孵育30分鐘。滴加一抗4℃下過夜，滴加二抗，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3次，每次2分鐘，甩干，DAB溶液顯色，鏡下觀察，蘇木素復染，沖洗，酒精梯度干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。Motic 3000顯微攝影系統(tǒng)攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達進行定量分析，積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度，在400倍視野拍攝分析，每組每次實驗隨機3次。

1.12 qRT-PCR法檢測H9c2細胞Caspase-9 mRNA表達

細胞培養(yǎng)同前，細胞收集后，使用RNA提取試劑盒提取細胞RNA，檢測RNA的濃度和產量以及RNA的完整性。按 “Reverse Transcription Reaction System”試劑盒說明書完成逆轉錄反應合成cDNA，將設計的引物序列與cDNA結合做RT-PCR，反應條件：Real-time PCR循環(huán)參數(shù)設定：95℃ 3分鐘，95℃ 30秒，62℃ 40秒，共40個循環(huán)。見表1。

表1 基因引物序列

1.13 Western Blot法檢測H9c2細胞Caspase-9蛋白表達

收集H9c2心肌細胞，提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，配膠完成SDS-PAGE蛋白質電泳，濃縮膠80 V，30分鐘，待溴酚藍指示劑移至凝膠底部時調到100 V，電泳結束后，PVDF膜轉膜，膜側為正極，膠側為負極，250 mA，2小時，取膜，麗春紅染液進行染色，脫脂牛奶封閉液，過夜，一抗、二抗孵育，顯影、定影。

1.14 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTT法檢測H9c2心肌細胞增殖活性

為了研究益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導H9c2心肌細胞凋亡的影響，從前期實驗中選取3個含藥血清濃度(8%、4%、2%)，并以卡托普利組作為陽性對照組，AngII造模時間為72小時，測OD值，并算出各實驗組細胞增值率。結果顯示：模型組與空白組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，增值率明顯降低。含藥血清高、中、低組OD值、增值率與模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且隨濃度的升高其增值率增高，具有劑量依賴性，含藥血清高劑量組增值率最高。含藥血清高劑量組與陽性對照組OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，含藥血清高劑量組增值率略低于卡托普利對照組。如表2。

2.2 Rho123觀察H9c2心肌細胞線粒體膜電位

如圖1所示：空白含藥血清組細胞熒光最強，呈明亮的熒光綠色；模型組細胞熒光強度明顯減弱，呈暗色調的熒光綠色。通過益氣溫陽活血利水方含藥血清預處理后線粒體膜電位明顯改善，高劑量組熒光與模型組比較熒光強度明顯增強，中劑量組較高劑量組差之，低劑量組僅稍有改善?？ㄍ衅绽M與含藥血清高劑量組無明顯差別。

表2 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導H9c2心肌細胞凋亡的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.3 免疫組化檢測H9c2細胞Bcl-2、Bax的表達

免疫組化結果示如圖2示：空白對照組Bcl-2、Bax蛋白未見明顯表達，呈弱陽性顯色。與空白對照組比較，AngII模型組Bcl-2蛋白表達減弱(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著增強(P<0.05)。與模型組比較，含藥血清組可見Bcl-2蛋白表達增高(P<0.05)，Bax蛋白表達下降(P<0.05)，呈正相關劑量依賴性趨勢，以高劑量組調節(jié)作用最為明顯。與陽性對照組比較，含藥血清高劑量組上調Bcl-2效果優(yōu)于卡托普利(P<0.05)，下調Bax效果遜于卡托普利(P<0.05)。見表3。

表3 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導H9c2細胞Bcl-2、Bax免疫活性的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.4 Real Time-PCR法檢測H9c2細胞Caspase-9的mRNA表達

正常情況Caspase-9的mRNA以一定量低表達，AngII處理72小時后表達含量明顯升高，含藥血清預處理組可以拮抗AngII導致兩者的升高表達，以含藥血清高劑量組拮抗效果最好?？ㄍ衅绽M下調作用優(yōu)于含藥血清高劑量組。見表4。

注：A 空白對照組；B 模型組；C 含藥血清高劑量組；D 含藥血清中劑量組；E 含藥血清低劑量組；F 卡托普利組

圖1 益氣溫陽活血利水方含藥血清作用后H9c2心肌細胞內Rho123熒光強度變化(72小時，×400)

注：A 空白對照組；B 模型組；C 含藥血清高劑量組；D 含藥血清中劑量組；E 含藥血清低劑量組；F 卡托普利組

圖2 益氣溫陽活血利水方含藥血清對AngII誘導H9c2細胞Bcl-2、Bax免疫活性的影響(72小時，×400)

表4 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細胞Caspase-9mRNA相對表達含量

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

2.5 Western Blot法檢測H9c2細胞Caspase-9蛋白的表達

AngII能夠促進H9c2心肌細胞的Caspase-9蛋白的表達，蛋白相對表達量與空白對照組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，不同濃度的益氣溫陽活血利水方含藥血清預處理后，可降低Caspase-9蛋白的表達含量，具有劑量依賴性，各含藥血清組蛋白相對表達量與AngII模型組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，卡托普利組結果優(yōu)于含藥血清高劑量組，兩者比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5和圖3。

表5 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細胞Caspase-9蛋白表達的影響

注：與空白對照組比較aP<0.05，與模型組比較bP<0.05，與卡托普利組比較cP<0.05。

注：1空白對照組；2模型組；3含藥血清高劑量組；4含藥血清中劑量組；5含藥血清低劑量組；6卡托普利組。

圖3 益氣溫陽活血利水方含藥血清對H9c2心肌細胞Caspase-9蛋白表達影響印跡圖

3 討論

在心血管疾病終末期階段，細胞凋亡是重要病理機制。細胞凋亡使心肌細胞數(shù)量絕對值減少，最終導致心肌收縮功能降低[4]。神經體液過度激活參與到了細胞凋亡的病理機制。Chen BC等[5]研究也證實AngII引起大鼠心肌細胞凋亡的發(fā)生。線粒體凋亡途徑是參與凋亡的重要機制，Bcl-2、Bax、Caspase-9是重要的分子機制。Bcl-2和Bax的表達含量決定細胞的命運，Bax表達占優(yōu)勢時，形成Bax同源二聚體，促進細胞凋亡；而Bcl-2表達占優(yōu)勢時，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡，通過兩者間的平衡調控細胞存亡[6]。定位在外膜的Bcl-2形成陽離子通道，使質子能從線粒體轉運到胞漿，避免膜間隙酸化而抑制Cyt-C的釋放，抑制凋亡；Bax通過與陰離子通道或直接使基質腫脹而誘發(fā)線粒體膜電位的改變，促進Cyt-C釋放而促進凋亡。Bcl-2家族亦可與Caspase直接結合調控細胞凋亡過程，形成Bcl-2-Apaf-1-Caspase復合物，抑制Caspase-9、Caspase-3的激活，但這種方式不影響Cyt-c和Apaf-1對Caspase-9的激活[7-8]。綜上，本課題選擇Bcl-2、Bax及Caspase-9線粒體凋亡過程的關鍵指標，來反應益氣溫陽活血利水方含藥血清對線粒體凋亡途徑的影響。

益氣溫陽活血利水方全方補而不助邪，瀉而不傷正，用藥精當，組方嚴謹，調補陰陽，溫補臟腑，重在溫補心腎，藥物組合即入“氣分”，也入“血分”。方中人參、黃芪為君藥，人參為群草之冠，大補元氣、滋補強壯；黃芪能夠固表驅邪，實腠理、強衛(wèi)氣，且有利水之功。桂枝溫通心陽，化氣助陽，平沖降逆；丹參活血化瘀，茯苓、白術健脾利濕，固中州助運化，共為臣藥。益母草活血化瘀利水；葶藶子瀉肺平喘利水，且與黃芪配伍，一升一降；仙鶴草補虛消積；淫羊藿溫腎助陽共為佐藥。甘草調和諸藥。以上諸藥共奏益氣溫陽、活血利水之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)人參的主要有效成分人參皂苷，具有調節(jié)神經內分泌功能，促進下丘腦分泌促腎上腺皮質激素，提高機體應激能力，同時可增加心肌細胞內cAMP含量，增強心肌細胞收縮力[9-10]；黃芪有利尿、抗衰老、增強應激和機體免疫力、抗菌的作用，同時擴張冠狀動脈，抑制心肌細胞凋亡[11-12]。桂枝能擴血管，改善血液循環(huán)，抗凝、抗纖維蛋白酶，且同時具有利尿作用。關于作用，《本草綱目》記載黃芪配桂枝：“黃芪補三焦，實衛(wèi)氣，與桂同功，特比桂甘平，不辛熱為異耳，但桂則通血脈，能破血而實力氣，芪則益氣也?！?/p>

本實驗研究通過前期預實驗總結，選用1×10-6mol/L AngII 72小時成功誘導細胞凋亡模型，AngII作用H9c2心肌細胞72小時后，MTT結果示，與正常對照組相比，AngII可顯著降低心肌細胞活性，益氣溫陽活血利水方含藥血清可以顯著拮抗AngII致使的細胞損傷，且這種拮抗作用具有正相關劑量依賴性，其中以含藥血清高劑量組(8%)效果最為顯著。本研究用qRT-PCR、Western Blot及免疫組化實驗方法檢測了線粒體凋亡途徑相關Bcl-2、Bax及Caspase-9的表達水平，結果示與空白對照組相比，模型組AngII損傷細胞后，Caspase-9的表達水平升高，Bcl-2/Bax的比例降低，AngII通過調節(jié)上述線粒體凋亡途徑相關基因及蛋白的表達而促使H9c2心肌細胞凋亡，本研究結果與Raul Vivar課題組用AngII誘導新生幼鼠原代培養(yǎng)心肌細胞凋亡以及線粒體凋亡相關基因及蛋白表達的改變結果一致[13]。益氣溫陽活血利水方含藥血清能顯著降低AngII誘導心肌細胞的凋亡水平，降低了AngII造模后升高的Caspase-9基因及蛋白和Bcl-2/Bax蛋白的表達水平，而且這種調節(jié)方式具有正相關劑量依賴性，以含藥血清高劑量組的調節(jié)方式和改善細胞的凋亡情況最好，最終有力證明益氣溫陽活血利水方含藥血清通過調節(jié)了線粒體凋亡途徑抑制了細胞凋亡。

綜上所述，筆者推斷益氣溫陽活血利水方含藥血清通過調節(jié)線粒體凋亡途徑Bcl-2、Bax蛋白的表達水平而抑制線粒體膜電位下降，抑制細胞色素C的釋放和Caspase-9的表達從而抑制細胞凋亡。