譚光輝，張依裕，吳 磊，覃媛鈺，李杰章

(貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

鈣釋放酶激活鈣調(diào)制器1(Orai calcium release-activated calcium modulator 1，ORAI1)屬于ORAI家族成員，同時也是鈣離子膜通道的一個亞型，它不僅調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子流入，而且還是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要元素[1]。前人研究表明，ORAI1蛋白是介導(dǎo)鈣離子信號的重要通道，是非興奮細(xì)胞內(nèi)最主要的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的方式[2-4]。DONG等[5]研究發(fā)現(xiàn)，ORAI1能夠控制細(xì)胞內(nèi)鈣離子的內(nèi)流，鈣離子內(nèi)流通過ORAI1通道間歇性激活。WANG等[6]和MOURA等[7]研究表明，ORAI1過表達(dá)增加了進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子量，并且ORAI1是神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)的調(diào)控因子之一，同時還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲備耗盡的傳感器。鴨ORAI1基因位于16號染色體上，有3個外顯子，4個變異體，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，包括子宮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中[8]。子宮是蛋殼形成主要部位，子宮內(nèi)蛋殼腺的黏膜分泌的蛋殼液沉積而成蛋殼，蛋殼液中含有大量的鈣離子[9]。因此，鈣離子與蛋殼品質(zhì)具有直接聯(lián)系。

DNA混合池是混合具有相同特征群體的DNA，PCR擴(kuò)增測序是直接檢測出單核苷酸突變位點(Single nucleotide polymorphism site,SNPs)的一種成本低、效率高的方法。利用DNA混合池和直接測序技術(shù)對未知的單核苷酸突變或已知SNPs等位基因頻率進(jìn)行快速篩查，可極大縮短試驗周期，是可行可信的SNPs篩選方法[10]。

三穗鴨原產(chǎn)于貴州三穗縣，是我國優(yōu)良地方品種，具有體型小、早熟、產(chǎn)蛋多、適應(yīng)性和牧飼力強(qiáng)的特點，且其肉質(zhì)細(xì)嫩、味美鮮香，深受人們喜愛。但隨著目前養(yǎng)殖技術(shù)的逐漸提高，因蛋殼破損帶來的經(jīng)濟(jì)損失越來越嚴(yán)重，產(chǎn)蛋高峰期尤為突出。鑒于此，以貴州三穗鴨為研究對象，采用DNA混合池和PCR直接測序法對三穗鴨ORAI1基因進(jìn)行SNPs篩選，并進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測，以期明確ORAI1基因?qū)θ滕喌皻て焚|(zhì)的影響，為在分子水平改善蛋殼品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

主要儀器：電泳儀(DYY-2C)購自北京六一儀器廠；梯度PCR儀(PTC200)購自美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計購自Thermo公司。

主要試劑：2×TaqPCR Master Mix 試劑和瓊脂糖購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker 購自重慶擎科生物科技有限公司；全血DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 血樣采集與DNA的提取

自貴州省三穗縣三穗鴨繁育中心采集200份三穗鴨血樣，保存于醫(yī)用采血管。采用全血DNA 提取試劑盒提取血液DNA[11]，紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，三蒸水調(diào)整DNA質(zhì)量濃度至100 ng/μL。各取2 μL DNA構(gòu)建DNA混合池，保存于 -20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

參照NCBI GenBank中鴨ORAI1基因序列(NC_040061.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計5對特異性引物(表1),引物由上海生工生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系30 μL：上、下游引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 15 μL，三穗鴨血液基因組DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足30 μL。PCR擴(kuò)增程序：96 ℃預(yù)變性5 min;96 ℃變性30 s、退火(溫度見表1) 50 s、72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，保存于4 ℃。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

表1 三穗鴨ORAI1基因的引物信息Tab.1 Primer information of Sansui duck ORAI1 gene

1.4 SNPs篩選和等位基因頻率估算

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇特異性良好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，送往上海生工生物有限公司測序。測序結(jié)果應(yīng)用MegAlign、EditSeq和DNAStar軟件比對拼接，獲得三穗鴨ORAI1基因編碼序列；采用Chromas軟件查看測序圖譜，MWSnap序列分析軟件標(biāo)尺測量三穗鴨ORAI1各突變位點等位基因峰圖高度，計算等位基因頻率：Fi=hi/(h1+h2)，式中,Fi為突變位點等位基因頻率，h1和h2為測序圖譜上該突變位點等位基因1和2的峰高度[12-13]。

1.5 生物信息學(xué)分析

按照文獻(xiàn)[12-13]中的軟件對三穗鴨ORAI1基因編碼區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測。采用在線軟件AAcompldent(http://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測三穗鴨ORAI1蛋白的理化性質(zhì)及疏水性和親水性；采用在線軟件RNAfold web server(http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測ORAI1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用在線軟件SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/#opennewwindow)分析ORAI1蛋白的信號肽；利用NetNGlyc 1.0軟件分析ORAI1蛋白的N-糖基化位點；應(yīng)用在線軟件PredictProtein預(yù)測ORAI1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL同源建模方法構(gòu)建ORAI1蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 三穗鴨ORAI1基因PCR擴(kuò)增

從圖1可以看出，三穗鴨ORAI1基因 5對引物擴(kuò)增結(jié)果特異性較好，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度相符，可用于下一步試驗。

M：DL2000 DNA Marker；A1—A3：第F1/R1對引物

2.2 三穗鴨ORAI1基因序列測定

將拼接的三穗鴨ORAI1基因與GenBank公布的鴨ORAI1基因的CDS區(qū)序列進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)3個SNPs(圖2)，均在外顯子3，分別命名為 T84C、C188T、A471G(以該基因CDS區(qū)第1個堿基開始計數(shù))。由于SNP位點核苷酸的密碼子存在簡并現(xiàn)象，3個SNPs均屬于非錯義突變，沒有造成氨基酸的突變。

圖2 三穗鴨ORAI1基因測序結(jié)果Fig.2 Results of ORAI1 gene sequencing in Sansui duck

2.3 三穗鴨ORAI1基因單核苷酸突變位點等位基因頻率估算

由表2可知，3個SNPs在突變前后等位基因頻率存在差異，其中T84C和C188T這2個突變位點在突變前后差異較大，并且突變后等位基因頻率均降低，而A471G突變位點在突變前后等位基因頻率差異較小，突變致使等位基因頻率增加。

表2 三穗鴨ORAI1基因突變位點等位基因頻率估算結(jié)果

2.4 蛋白質(zhì)功能預(yù)測

2.4.1 SNPs對三穗鴨ORAI1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響 以O(shè)RAI1基因CDS區(qū)為參考序列(No.:NC_040061.1)，分別預(yù)測三穗鴨ORAI1基因CDS區(qū)T84C、C188T以及A471G突變對其mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響。對比參考序列，3個SNPs突變后其mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并導(dǎo)致其自由能發(fā)生改變(圖3)。與參考序列相比，T84C突變位點，自由能變化較小(由-249.00 kcal/mol變?yōu)?-247.60 kcal/mol)，二級結(jié)構(gòu)變化不是很明顯；C188T(由-249.00 kcal/mol變?yōu)?-252.60 kcal/mol)和A471G(由-249.00 kcal/mol變?yōu)?-250.20 kcal/mol)突變位點自由能變化較大，二級結(jié)構(gòu)改變較為明顯;3個SNPs在突變后均引起自由能變化。

圖3 三穗鴨ORAI1基因mRNA二級結(jié)構(gòu)

2.4.2 三穗鴨ORAI1蛋白理化性質(zhì)分析 三穗鴨ORAI1基因編碼區(qū)全長792 bp，具有1個完整的開放性閱讀框(Open reading frame,ORF)，含有起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)，編碼263個氨基酸。從表3可以看出，絲氨酸(Ser)數(shù)量最多(32個)，占整個氨基酸組成12.2%，半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)數(shù)目最少(3個)，占整個氨基酸組成1.1 %。正、負(fù)電荷殘基總數(shù)分別是17、20個。對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用的半胱氨酸(Cys)3個；蛋白質(zhì)分子式C1 288H2 053N351O370S10，理論等電點8.85，不穩(wěn)定系數(shù)為49.59，大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。

表3 三穗鴨ORAI1蛋白氨基酸組成

2.4.3 三穗鴨ORAI1蛋白親水、疏水性預(yù)測 三穗鴨ORAI1蛋白親水性和疏水性預(yù)測結(jié)果如圖4所示，第230位的精氨酸(Arg)親水性最強(qiáng)(-2.611)，第213位的異亮氨酸(Ile)疏水性最強(qiáng)(3.133)。整個氨基酸肽鏈中疏水性氨基酸占47.1%，親水性氨基酸占52.9%，總體體現(xiàn)為親水性。

2.4.4 三穗鴨ORAI1蛋白信號肽分析 三穗鴨ORAI1蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果如圖5所示。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測一般包含3個重要參數(shù)C值、Y值和S值。信號肽剪切位點C值最大，S值陡峭，Y值最高峰?？梢姡滕哋RAI1蛋白不存在信號肽。

2.4.5 三穗鴨ORAI1蛋白的 N-糖基化位點分析 三穗鴨ORAI1蛋白中有2個潛在的N-糖基化位點，分別是Asn179和Asn186(圖6)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)共價結(jié)合糖鏈結(jié)構(gòu)形成糖基化位點，密切聯(lián)系蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，能夠定向調(diào)控蛋白質(zhì)的功能，并參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和發(fā)育等功能[14]。據(jù)報道，蛋白質(zhì)糖基化位點可修飾細(xì)胞內(nèi)蘭尼堿受體，影響鈣離子釋放，還能引起細(xì)胞膜電位以及鈣通道的改變，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平[15-17]。由此預(yù)測，三穗鴨ORAI1蛋白可能調(diào)控機(jī)體鈣離子濃度，從而與蛋殼品質(zhì)密切相關(guān)。

圖5 三穗鴨ORAI1蛋白的信號肽分析結(jié)果Fig.5 Signal peptide analysis results of Sansui duck ORAI1 protein

圖6 三穗鴨ORAI1蛋白的 N-糖基化位點預(yù)測結(jié)果

2.4.6 三穗鴨ORAI1蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 三穗鴨ORAI1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖7)，159個氨基酸構(gòu)成α螺旋，占總氨基酸60.46%;78個氨基酸構(gòu)成無規(guī)卷曲，占比29.66%;另外23個氨基酸和3個氨基酸分別構(gòu)成延伸鏈和β轉(zhuǎn)角，分別占整個氨基酸8.75%和1.14%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明(圖8)，三穗鴨ORAI1蛋白主要由α螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

h:α螺旋；t:β轉(zhuǎn)角；c:無規(guī)卷曲；e:延伸鏈

圖8 三穗鴨ORAI1蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，ORAI1基因變異可改變?nèi)薣18]、牛[19]、鼠[20]組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以及機(jī)體鈣離子釋放量。YAMASHITA等[21]研究表明,ORAI1基因突變，可改變機(jī)體組織細(xì)胞鈣離子濃度；同樣，鈣離子作為一種普遍存在的第二信使，正常的細(xì)胞和組織生理嚴(yán)格依賴于鈣離子進(jìn)入、儲存和釋放的精確調(diào)控，小鼠ORAI1基因變異引起細(xì)胞鈣離子濃度改變，進(jìn)而影響小鼠細(xì)胞的增殖和凋亡，特別T細(xì)胞和B細(xì)胞，對小鼠免疫產(chǎn)生極大影響[22]。由此推測，ORAI1基因也可能影響家禽機(jī)體鈣離子濃度，諸如影響骨鈣素沉積和鈣蛋殼形成的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖，能夠作為提高地方鴨蛋殼品質(zhì)的分子標(biāo)記輔助選擇。鴨ORAI1基因有3個外顯子、2個內(nèi)含子。本研究在三穗鴨ORAI1基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)3個SNPs(T84C、C188T、A471G)，均在三穗鴨ORAI1基因第3外顯子，其他2個外顯子未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，揭示三穗鴨ORAI1基因第3外顯子編碼的氨基酸序列是蛋白質(zhì)功能主要集中區(qū)域。3個SNPs未改變編碼氨基酸，屬于同義突變?？梢姡琌RAI1基因序列和結(jié)構(gòu)保守性較高，以及密碼子簡并性使得蛋白質(zhì)未引起突變。研究發(fā)現(xiàn)，同義突變不會造成氨基酸的改變，但它們可能會反復(fù)改變調(diào)控剪接的外顯子基序，如果這些突變位點與剪接位點相鄰可能導(dǎo)致剪接位點失活，改變mRNA的剪切效率或準(zhǔn)確性，從而影響蛋白質(zhì)的功能、構(gòu)象和表達(dá)水平,進(jìn)而影響生物學(xué)功能[23-25]。對三穗鴨ORAI1基因的mRNA預(yù)測結(jié)果表明，3個SNPs突變后，其mRNA二級結(jié)構(gòu)和自由能均發(fā)生了改變，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也會受到影響。

蛋白質(zhì)作為生命活動的承擔(dān)者，在基因調(diào)控中扮演重要角色，同時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)又影響著動物生命活動代謝，其一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)相互影響，發(fā)揮重要的生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，三穗鴨ORAI1蛋白由263個氨基酸折疊而成，為親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為49.59(大于40)，屬于不穩(wěn)定蛋白。在ORAI1蛋白氨基酸組成中，數(shù)目最多的是絲氨酸(Ser)，比雞多1個，比羊少3個；對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用的半胱氨酸(Cys)有3個，與雞和羊數(shù)量相同，揭示在各種動物中ORAI1蛋白的半胱氨酸高度保守。本研究中，三穗鴨ORAI1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要包含由159個氨基酸構(gòu)成的α螺旋以及由78個氨基酸構(gòu)成的無規(guī)卷曲。按組成氨基酸的α螺旋比例大于46%、同時β轉(zhuǎn)角比例小于5%的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分型標(biāo)準(zhǔn)，三穗鴨ORAI1蛋白二級結(jié)構(gòu)屬于非混合型蛋白，這種結(jié)構(gòu)是否影響該蛋白質(zhì)的能量代謝、運(yùn)輸和結(jié)合等過程，還有待進(jìn)一步探討。