趙峻麗，陳 雯，石 敏

(浙江農林大學 農業(yè)與食品科學學院，浙江 杭州 311300)

低溫是嚴重影響作物生長發(fā)育乃至產量、品質的非生物脅迫之一。全球每年都有大批的農作物因遭受低溫而大量減產，因此,植物如何抵御低溫脅迫成為研究熱點。當植物受到外界低溫刺激時，COR(Cold regulated)基因被激活并表達，從而提高植物對低溫的耐受力。通過對模式植物擬南芥COR基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析，鑒別出一個9 bp的DRE元件(Dehydration responsive element)，該元件能夠對脫水、鹽和低溫產生反應[1]，其核心序列為CCGAC，稱為CRT(C-repeat)，能夠被低溫誘導[2]。植物中存在2條低溫脅迫響應調控途徑，即ABA依賴型與非ABA依賴型調控途徑，而非ABA依賴型調控途徑又可分為依賴于CBF(C-repeat binding transcription factor)的調控途徑和不依賴于CBF的調控途徑[3]。不依賴于CBF的調控途徑包括ROS-bZIP-CRT/DRE (Reactive oxygen species-basic leucine zipper-CRT/DRE)和MYC/MYB(Myelocytomatosis related protein/myeloblastosis retated protein)-MYCRE/MYBRE 2條途徑[4]。近年來，對依賴于CBF的調控途徑的研究最多。CBF屬于AP2/ERF(APETALA2/ethylene response protein)類家族的轉錄因子，也被稱為DREB (Dehydration responsive element binding protein),在植物響應低溫脅迫中起著重要的作用[5-6]。CBF通過結合抗凍相關基因啟動子區(qū)域的順式作用元件，從而調節(jié)抗凍相關基因的表達，如COR47、COR15a、COR78、COR6.6等，以此提高植物的抗凍性[7]。目前，最經典的低溫反應通路是ICE1 (Inducer of CBF expression 1)-CBF-COR通路。在該通路中，ICE1的降解通過HOS1 (High osmotic expression 1)所介導的泛素化途徑進行,HOS1在擬南芥中是一個E3泛素化連接酶，當植物受到低溫脅迫時，HOS1通過與ICE1互作導致ICE1降解，抑制CBF及其下游基因的表達，從而調控植物的耐冷性[8]。對CBF基因的功能及其調控基因、調控CBF的上游基因及植物激素與CBF互作等方面進行綜述，并展望了CBF在農業(yè)生產上的應用前景，以期為深入研究CBF的耐冷機制奠定基礎，為利用基因工程技術培育耐冷作物品種提供參考。

1 植物中CBF基因的功能及其調控的下游基因

目前，對CBF基因功能的研究很多[3]。低溫處理cbf1/2/3三突變體擬南芥幼苗，發(fā)現三突變體比單突變體對低溫的敏感性更強[9-10]。CBF基因在常溫條件下表達量很低，但是低溫刺激下表達量在幾分鐘之內迅速升高，經過幾小時后恢復到原始水平[6,11-12]。植物中CBF對下游基因的調控主要表現在影響植物的耐冷性方面， CBF主要調控COR基因發(fā)揮其功能，其中對COR15a基因的研究較深入，COR15a基因在植物體中具有保護葉綠體以及原生質體的作用[13-14]。除COR基因,研究還發(fā)現，CBF可激活RAP2.6(Related to APETALA 2.6)和RAP2.1基因[15]。前人研究發(fā)現，COR78和rd29A、COR47和rd17分別是同一個基因，同時發(fā)現在油菜(Brassicanapus)中Bn115和Bn28、小麥中Wcs120(Wheat cold acclimation 50 ku protein 120)和Wcs200也受低溫誘導表達[15]，并且這些基因中的啟動子區(qū)域與COR基因一樣都含有CRT/DRE結合元件，CBF能夠與之結合從而促進其表達。CBF基因除了主要參與低溫脅迫響應外，還參與干旱、高鹽脅迫響應[16-18]。

2 植物中調控CBF基因的相關蛋白研究進展

在之前的研究中，對于CBF基因的上游研究較多，在正常溫度下，CBF表達維持在低水平，使植株正常生長；在低溫下，CBF可以被一些轉錄因子、蛋白激酶調控表達，響應低溫脅迫[19]。

2.1 調控CBF基因的轉錄因子

CBF基因家族在擬南芥中有CBF1—CBF3三個成員，均位于4號染色體上[11-12]。研究表明cbf1、cbf2、cbf3對低溫呈現出敏感性[9-10]。在擬南芥CBF調控網絡中，ICE1為bHLH( Basic helix-loop-helix)家族中的轉錄因子，能夠與CBF啟動子上的MYC結合元件結合并促進其表達[20-21]，參與CBF-COR抗凍調控網絡，形成ICE1-CBF-COR信號通路。除了ICE1，其他轉錄因子也可以與CBF啟動子序列結合并且調控其表達。CBF啟動子中含多個MYB結合序列，表明CBF基因的表達可能受MYB轉錄因子調控。研究表明，myb15缺失突變體中CBF的表達水平顯著升高，突變體對于低溫的耐受性也顯著增強；進一步研究發(fā)現，MYB15與CBF啟動子直接結合并負調控CBF的表達[22]。類似的，MYB3在正常條件下直接與CBF4啟動子結合并且抑制其表達；低溫可直接誘導MYB61基因表達，其通過抑制MYB3與CBF4的結合而增強CBF4的轉錄，從而提高植物對低溫的耐受性[23]。MYB31在低溫下可促進CBF基因的表達，增強植物對低溫和氧化應激的抵抗力[24]。

植物色素、紅光與遠紅光的比例與植物的冷馴化和低溫耐受性相關[25-27]。光敏色素B以及2個光敏色素相互作用因子(Phytochrome-interacting factors，PIF)PIF4和PIF7在長日照條件下會抑制CBF表達[26]。PIF3與CBF啟動子的上G-box和E-box結合，在黑暗與低溫條件下抑制CBF的轉錄，從而降低植物對低溫的耐受性[26]。另外，研究發(fā)現，紅光與遠紅光比例較低時能增加CBF基因表達量[27]。

2.2 調控CBF基因的蛋白激酶

在植物體中，蛋白質修飾會影響蛋白質的活性、定位及穩(wěn)定性等[28]。目前，已發(fā)現多個蛋白質修飾類型參與低溫脅迫響應，主要包括泛素化、磷酸化修飾等[29-30]。研究發(fā)現，ICE1蛋白能夠與HOS1(High expression of osmotically responsive gene 1)、SIZ1(SUMO-protein ligase)、OST1(Open stomata 1)、MPK3(Mitogen-activated protein kinases 3)、MPK6以及 BTF3(Basic transcription factor 3)等蛋白質相互作用調控CBF的表達[8，20，31]。植物體中HOS1通過對ICE1進行泛素化降解破壞ICE1的穩(wěn)定性從而導致下游的CBF表達量降低，屬于負調控因子[8]。SIZ1是一個泛素化連接酶，介導ICE1的泛素化修飾而增加它的穩(wěn)定性，并降低HOS1對ICE1的泛素化作用[31]。

蛋白質磷酸化在植物響應低溫脅迫中也具有重要作用[28]。在植物中，OST1是ABA信號途徑中的蛋白激酶[32]，通過磷酸化修飾ICE1抑制HOS1對ICE1的26S蛋白酶體所介導的泛素化降解[33]。EGR2 (E growth-regulating 2)磷酸酶通過抑制OST1激酶活性從而降低植物的低溫耐受能力[34]。MAPK信號級聯對于低溫的耐受性主要通過ICE1-CBF-COR信號通路發(fā)揮作用[35-36]。在植物中,MAP3K受到刺激后激活質膜受體，激活的MAP3K磷酸化MAP2K，MAP2K的磷酸化激活MAPK[37]。MAPK對調節(jié)植物低溫耐受性具有積極的作用[38]。植物中MPK4和MPK6在低溫下能被誘導表達[39-40]；MKK2也在低溫下能夠被激活，且進一步激活MPK4和MPK6[38]。MPK3/MPK6使ICE1磷酸化并且抑制它的轉錄活性，進而ICE1被泛素化降解，引起CBF基因的表達量下降，導致植物對低溫的耐受性降低[36]。

3 植物激素參與CBF途徑的研究進展

研究表明，乙烯的缺失會降低番茄的低溫耐受性，但是乙烯利處理能夠提高番茄的低溫耐受性[41]；而抑制乙烯的生物合成通路下調了番茄CBF1基因的表達，降低了番茄的低溫耐受能力，表明乙烯的生物合成通路能夠正向調控番茄的低溫耐受能力[42]。過表達SlERF2(Solanumlycopersicumethylene response factor 2)能夠增強轉基因煙草和番茄植株的低溫耐受能力，SlERF2沉默表達出現相反的結果[43]。EIN3 (Ethylene insensitive 3)對于植物的低溫耐受性起負調控作用，其能夠與CBF啟動子區(qū)的EBS(Ets-binding site)結合，從而影響CBF的表達[44]。EBF1/2(EIN3-binding F-BOX 1/2)是乙烯信號通路中的2個F-box蛋白，通過抑制EIN3和PIF3的表達而正向調控CBF的表達[27,44]。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)是影響許多植物生理過程的一類激素，也參與植物冷脅迫響應。HAN1(Han termed chilling in Chinese)編碼1個氧化酶，通過代謝的方法激活茉莉酸在植物生長發(fā)育與逆境脅迫過程中發(fā)揮作用，還可阻止低溫條件下茉莉酸的過度積累，使植物在恢復正常條件后能夠正常生長。正常條件下，han1缺失突變體的生長速率與野生型相比明顯受到了抑制；但是在低溫條件下，缺失突變體的存活率明顯高于野生型，而HAN1過表達植株在低溫條件下耐受性明顯低于野生型[45]。茉莉酸能夠調節(jié)ICE1與JAZ1/4(Jasmonate zim-domain protein 1/4)蛋白的互作，進而調控CBF的表達[46]。使用外源茉莉酸甲酯可以提高蘋果中冷脅迫響應基因bHLH1、CBF1、CBF2和CBF3的表達水平，從而增強蘋果的低溫耐受性[47]。

植物類固醇激素，如BR(Brassinosteroids)，也在提高低溫耐受性方面發(fā)揮作用[48]。BIN2(Brassinosteroid insensitive 2)是一種參與BR信號的蛋白激酶，介導PIF3的磷酸化和降解[49]。BR不存在的情況下，BIN2活化2個同源轉錄因子BZR1(Brassinazole-resistant 1)和BES1(BRI1-EMS-suppressor 1)，從而促進BZR1與BES1的降解；BR存在的情況下，BIN2被BSU1( BRI1 suppressor 1)去磷酸化以及被26S蛋白酶體降解，隨后釋放BZR1和BES1，解除BIN2對BZR1和BES1的抑制作用[50-52]，BZR1和BES1去磷酸化積累在細胞核內[51,53-54]。低溫脅迫響應中，BIN2以及其同系物起負調控作用，然而BZR1和BES1有正向調節(jié)低溫脅迫響應的作用，BZR1通過與CBF1/CBF2的啟動子直接結合來提高CBF的表達，從而提高植物對低溫的耐受性[55]。

SA(Salicylic acid)是一種重要的植物抗病性激素。研究表明，SA受體NPR1(Non expressor of pathogenesis-related gene 1)在植物的低溫響應中發(fā)揮重要的作用，低溫誘導胞質NPR1進入細胞核內，SA在抵御病原體的反應中也是如此[56-57]，此發(fā)現表明病原體抵御反應和低溫響應反應機制中有許多相通的部分。同樣的蛋白質(NPR1)通過改變自身的構象來感知低溫和病原體信號[58]，然而其在不同的應激條件下是如何被調控的，需要進一步深入研究。

4 展望

低溫對農作物的生長發(fā)育以及農作物的種植分布有著巨大的影響，但是當農作物遭受低溫脅迫時，機體會對外界刺激做出應答，防御低溫傷害，其調控網絡錯綜復雜。前人在低溫響應機制的研究中取得了開創(chuàng)性的進展。在低溫脅迫響應中，除了CBF通路的參與，還有許多轉錄因子參與低溫脅迫響應。之前大多數研究都是圍繞ICE1進行，但是根據新的研究發(fā)現，CBF蛋白能被26S蛋白酶體降解，說明有1個未知的E3連接酶參與這條途徑并發(fā)揮功能，目前并不明確，因此需要對其進行更深入的研究[19]。