王 凡，李聰歌，馬雅雯，劉 飛，孟祥杰

(洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)因其獨(dú)特的口味而深受廣大消費(fèi)者的青睞，是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖最為廣泛的冷水魚之一，同時(shí)也是營養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域的一種典型模式水生生物。隨著大面積養(yǎng)殖的推廣和集約化程度的不斷提高，虹鱒的病害問題日趨嚴(yán)重[1]。預(yù)防和治療疾病的最有效措施是使用抗生素，但傳統(tǒng)抗生素的負(fù)面效應(yīng)較大，容易導(dǎo)致藥物殘留，同時(shí)也會(huì)造成病原微生物的耐藥性和對(duì)水環(huán)境的危害。已有研究表明，非特異性免疫在魚病防治中扮演著重要角色[2]。因此，如何提高虹鱒的非特異性免疫功能、提高魚類的抗病力已成為其健康養(yǎng)殖過程中的關(guān)鍵問題。

與抗生素相比，中草藥具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫、促生長、無藥物殘留和來源廣泛等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，常被稱為天然抗生素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，很多專家也提出用中草藥來替代抗生素的思路。已有研究表明，中草藥能夠促進(jìn)魚類的生長、增強(qiáng)魚類的非特異性免疫功能、提高魚類的抗病力[2-4]。山藥是一種營養(yǎng)成分極高的中草藥，山藥中的微量元素及生物活性物質(zhì)可以促進(jìn)新陳代謝，合成蛋白質(zhì)和各種酶，提高動(dòng)物的生長性能，增強(qiáng)免疫力。已有研究表明，山藥能夠明顯提高黃河鯉(Cyprinuscarpio)血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)及其補(bǔ)體3的含量、血液中硝基四氮唑藍(lán)(NBT)陽性細(xì)胞數(shù)，降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)含量[5]。但迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)山藥對(duì)虹鱒免疫調(diào)控方面的研究。為此，研究山藥提取物對(duì)虹鱒生長和非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討山藥對(duì)虹鱒免疫調(diào)控的分子機(jī)制，以期為山藥作為飼料添加劑在虹鱒養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)飼料的制備 將20∶1山藥提取物(每20 g山藥原材料，提取出1 g的山藥提取物；購自陜西森弗天然制品有限公司，薯蕷皂素含量16%)分別以0.1%、0.2%、0.4%的比例加入到虹鱒基礎(chǔ)飼料的配方中，制成含有山藥提取物的飼料，同時(shí)制備基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料中不含山藥提取物，由此得到4種試驗(yàn)飼料。飼料原料經(jīng)稱取、粉碎，混勻后使用ZL-600顆粒機(jī)制作直徑1.5 mm顆粒飼料，陰干24 h，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試動(dòng)物 虹鱒(Oncorhynchusmykiss)購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長7.6～8.9 cm，放在洛陽師范學(xué)院冷水魚養(yǎng)殖工程研究中心冷水魚循環(huán)系統(tǒng)中的飼養(yǎng)缸(直徑×高=1 m×1 m)，用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)14 d。冷水魚循環(huán)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水溫、pH值和溶解氧(DO)、氨氮(NH3-N)含量，每天定時(shí)、定點(diǎn)投餌3次，并記錄投餌量及殘餌量。暫養(yǎng)期間水溫為11～15 ℃，pH值為7.0±0.2，DO>8 mg/L，NH3-N<0.007 5 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取暫養(yǎng)后體態(tài)均勻、體質(zhì)量為10.6～12.8 g且健康的虹鱒幼魚進(jìn)行試驗(yàn)。將供試虹鱒分為4組，對(duì)照組和3組山藥提取物組，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，養(yǎng)殖周期為56 d，按照魚體質(zhì)量的3%～4%進(jìn)行飼料投喂。各組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾，整體稱質(zhì)量后放入魚缸中，試驗(yàn)期間水質(zhì)條件和飼料管理?xiàng)l件同暫養(yǎng)期。

1.2.2 樣品制備 投喂試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，每缸虹鱒整體稱質(zhì)量后，每組取6尾(每缸隨機(jī)選取健康且大小均勻的2尾)，測(cè)量體長、稱量質(zhì)量。然后用酒精棉將魚體消毒，再用已經(jīng)消毒處理過的工具尾靜脈取血，置于離心管中，在室溫下放置1 h，再置于冰箱中4 ℃過夜，3 500 r/min離心15 min，制得血清，然后將其放置-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生長性能指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)虹鱒養(yǎng)殖后的終末體質(zhì)量和養(yǎng)殖前的初始體質(zhì)量，計(jì)算增重率(WGR)和特定生長率(SGR)。

WGR(%)=100×(終末體質(zhì)量-

初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量；

SGR(%/d)=100×(ln終末體質(zhì)量-

ln初始體質(zhì)量)/試驗(yàn)天數(shù)。

1.2.4 血清非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定 血清抗菌活力(Anti-bacterial activity,AA)的測(cè)定采用HULTMARK等[6]的改進(jìn)方法。將活化后的大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)，在搖床中35 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，然后用0.1 mol/L、pH值6.4的PBS緩沖液洗滌2次，將大腸桿菌配成A570為0.3～0.5的懸液，取300 μL該懸液于96孔酶標(biāo)板孔內(nèi)，冰浴，加入5 μL待測(cè)上述血清樣品，混勻，在酶標(biāo)儀中570 nm波長處測(cè)A0值;然后將酶標(biāo)板移入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置30 min，取出后再置冰浴中10 min，終止反應(yīng)，再在酶標(biāo)儀中570 nm波長處測(cè)其A值。

血清中溶菌酶(LZM)的活性測(cè)定采用比濁法，總蛋白(TP)含量測(cè)定采用BCA法，白蛋白(ALB)含量測(cè)定采用溴甲酚綠法，酸性磷酸酶(ACP)活性、堿性磷酸酶(ALP)活性和GPT活性測(cè)定采用微量酶板法，尿素氮(BUN)含量測(cè)定根據(jù)脲酶法，肌酐(CREA)含量測(cè)定采用肌氨酸氧化酶法。上述指標(biāo)的測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用WST-8法進(jìn)行測(cè)定，其試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

血清中的補(bǔ)體4(C4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素2(IL-2)、白介素6(IL-6)的含量采用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并利用Dunnett’s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥提取物對(duì)虹鱒生長性能的影響

由表1可知，山藥提取物組虹鱒的WGR和SGR與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)?？梢?，山藥提取物對(duì)虹鱒的生長無顯著影響。

表1 山藥提取物對(duì)虹鱒生長指標(biāo)的影響

2.2 山藥提取物對(duì)虹鱒血清抗菌能力和抗氧化酶活性的影響

與對(duì)照組相比，山藥提取物組虹鱒的LZM和SOD活性有升高趨勢(shì)(表2)，0.1%、0.2%、0.4%的山藥提取物組LZM活性分別顯著升高了42.41%(P<0.01)、34.95%(P<0.01)和27.89%(P<0.05)；0.2%和0.4%山藥提取物組SOD活性分別顯著升高了82.14%(P<0.01)和110.71%(P<0.01)。山藥提取物組的AA和對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note:* indicates significant difference compared to the control (P<0.05 ),** indicates highly significant difference compared to the control (P<0.01).The same below.

2.3 山藥提取物對(duì)虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，山藥提取物組虹鱒的TP含量、ALB含量和ACP活性有升高趨勢(shì)；BUN含量、CREA含量、GPT活性和ALP活性有降低趨勢(shì)(表3)。0.4%山藥提取物組ALB含量和ACP活性分別顯著升高了30.73%(P<0.01)和63.77%(P<0.05)；0.2%和0.4%山藥提取物組TP含量分別顯著升高了36.49%(P<0.05)和45.97%(P<0.01)。0.1%、0.2%和0.4%山藥提取物組BUN含量分別顯著降低了51.20%(P<0.01)、64.06%(P<0.01)和49.80%(P<0.01)；0.2%和0.4%山藥提取物組ALP活性分別顯著降低了51.60%(P<0.01)和56.75%(P<0.01)；0.1%和0.2%山藥提取物組GPT活性分別顯著降低了77.37%(P<0.01)和60.71%(P<0.01)；0.1%山藥提取物組CREA含量顯著降低了41.96%(P<0.01)。

表3 山藥提取物對(duì)虹鱒血清生化指標(biāo)的影響

2.4 山藥提取物對(duì)虹鱒血清補(bǔ)體和細(xì)胞因子的影響

山藥提取物對(duì)虹鱒血清的補(bǔ)體4及細(xì)胞因子含量的影響見圖1。與對(duì)照組相比，山藥提取物組C4含量和細(xì)胞因子含量均呈升高趨勢(shì)，其中C4含量顯著性升高，0.1%、0.2%和0.4%山藥提取物組分別升高了154.35%(P<0.05)、144.03%(P<0.05)和304.68%(P<0.01)；0.2%和0.4%山藥提取物組的IL-6含量分別升高了45.01%(P<0.01)和56.25%(P<0.01)；0.2%和0.4%山藥提取物組的TNF-α含量分別升高了247.32%(P<0.01)和414.15%(P<0.01)；0.2%山藥提取物組IL-2含量顯著升高了87.59%(P<0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論與討論

中草藥作為飼料添加劑在魚類中的研究表明，其具有促生長的作用，尤其在復(fù)方中草藥中表現(xiàn)比較明顯[3-4]。但本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過56 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，山藥提取物組虹鱒的WGR和SGR與對(duì)照組比差異不顯著，這與山藥粉在黃河鯉的試驗(yàn)研究中結(jié)論一致[5]，表明單一的山藥可能對(duì)硬骨魚類的生長性能影響不大。

血清生化指標(biāo)水平經(jīng)常被用來評(píng)價(jià)動(dòng)物的健康、營養(yǎng)和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)情況。BUN、CREA含量常是衡量腎功能的主要指標(biāo)，它們?cè)谀撤N程度上反映了腎小球的濾過功能。本研究中，山藥提取物能使虹鱒血清BUN含量極顯著降低，且CREA含量也有降低的趨勢(shì)，這表明山藥提取物增強(qiáng)了虹鱒腎臟的機(jī)能。GPT活性是衡量肝功能的常用生化指標(biāo)之一，肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，它們通常會(huì)升高。本研究中，山藥提取物組的GPT活性有降低的趨勢(shì)，且在0.1%和0.2%山藥提取物組極顯著降低。這表明山藥提取物沒有對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，反而對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。血清中TP、ALB的含量是機(jī)體吸收、合成和分解蛋白質(zhì)的標(biāo)志性指標(biāo)，也是機(jī)體免疫水平的間接反映[7]。ACP和ALP是動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，ACP被認(rèn)為是高等動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，直接用于磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，參與能量的轉(zhuǎn)化和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，有助于磷酸二腺苷和磷酸三腺苷的合成，進(jìn)而提高機(jī)體的非特異性免疫水平和營養(yǎng)代謝水平[8]。ALP是一種重要的代謝調(diào)控酶，在堿性介質(zhì)中可通過水解作用將表面帶有磷酸酯的異物清除掉，同時(shí)參與鈣、磷的代謝，在魚類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用方面發(fā)揮重要作用，其活性的高低與動(dòng)物的生長性能關(guān)系密切[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，山藥提取物提高了虹鱒血清中TP、ALB含量和ACP活性，而降低了ALP活性，表明山藥提取物通過提高血清TP、ALB的含量和ACP活性增強(qiáng)了虹鱒的免疫機(jī)能。崔曉翠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，檳榔、川楝子復(fù)方中草藥既能提高大黃魚(Larimichthyscrocea)血清中ACP活性，也能提高ALP的活性；李思明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍、薄荷葉等復(fù)方中草藥也能夠同時(shí)提高中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)血清中ACP、ALP與活性。這些研究結(jié)果中的中草藥對(duì)ALP的影響與本研究結(jié)果不一致，可能是由于復(fù)方中草藥通過ALP來調(diào)控水產(chǎn)動(dòng)物免疫的機(jī)制和山藥提取物不同所導(dǎo)致的。

LZM是動(dòng)物體內(nèi)一種非特異免疫因子，可以溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁和調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌，也能夠促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)有益菌的增殖，它的活性和抗菌活力直接關(guān)系到魚類的免疫與健康[12]。SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的一種清除超氧自由基的抗氧化酶，它的活性與生物的免疫水平密切相關(guān)。本研究中，山藥提取物能使虹鱒血清的LZM活性顯著升高，0.2%和0.4%山藥提取物組的SOD活性也顯著升高。這表明山藥提取物促進(jìn)了LZM和SOD的生物合成，從而提高了機(jī)體的LZM、SOD活性，增強(qiáng)了機(jī)體的抗病力與免疫力。

補(bǔ)體系統(tǒng)由多于35種可溶性血漿蛋白組成，其在先天性免疫中具有良好的作用，包括趨化、調(diào)理和消滅病原體[13-15]，補(bǔ)體的激活可以促進(jìn)B細(xì)胞增殖、連接先天免疫系統(tǒng)與后天免疫系統(tǒng)[16-18]。C4是補(bǔ)體系統(tǒng)中重要的分子，也是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的重要組分。本研究中，山藥提取物組的C4含量顯著升高，表明山藥提取物可以提高C4的表達(dá)與分泌，促進(jìn)補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑，從而提高了虹鱒的免疫力和抗病力。陳成勛等[19]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以提高石斑魚(Epinepheluscoioides)血清的C4含量，MUSTHAFA等[20]發(fā)現(xiàn)，添加一定劑量南瓜子喂養(yǎng)莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)，喂養(yǎng)28 d，補(bǔ)體活性顯著增高。這些研究進(jìn)一步說明了中草藥可以通過促進(jìn)補(bǔ)體的分泌與活化而對(duì)魚類先天免疫反應(yīng)有較明顯的促進(jìn)作用。

魚類體內(nèi)大部分細(xì)胞因子特別是促炎細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-2和IL-6等)都與細(xì)菌、病毒、炎癥或細(xì)胞增殖以及趨化作用有關(guān)。TNF-α是巨噬細(xì)胞受到病原體等有害刺激產(chǎn)生的一種小分子蛋白。它能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性，是炎癥反應(yīng)必需的介質(zhì)，也是一種多效性的免疫調(diào)節(jié)因子[21]。IL-2和IL-6分別是輔助性T細(xì)胞的2個(gè)亞群(TH1和TH2)分泌的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用[22]。本研究中，0.2%和0.4%的山藥提取物可以顯著提高虹鱒血清中的TNF-α、IL-6含量，且0.2%山藥提取物組IL-2含量也顯著性提高。這些結(jié)果表明了山藥提取物促進(jìn)促炎癥因子表達(dá)與分泌，從而增強(qiáng)了虹鱒的免疫功能。

綜上，在虹鱒基礎(chǔ)飼料中添加山藥提取物(20∶1)，對(duì)其生長性能無顯著影響，但可以提高血清TP、ALB、C4、 TNF-α、IL-2、IL-6的含量，SOD、LZM、ACP活性，從而提高虹鱒的免疫功能。建議虹鱒飼料中山藥提取物(20∶1)添加水平為0.2%～0.4%。