潘 靜,劉潤(rùn)峰,高敬雨
(北京明德立達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司,北京 102206)
咪鮮胺(prochloraz)化學(xué)名稱:N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]咪唑-1-甲酰胺,是一種廣譜性殺菌劑,廣泛用于治療和鏟除由尾孢屬、核腔菌屬、喙孢屬、核盤菌屬、鐮孢屬及白粉菌、炭疽菌等致病菌所引起的油料作物、谷類、熱帶和亞熱帶水果、觀賞植物、蔬菜及各種經(jīng)濟(jì)作物的病害,也用于種子、苗木處理及防治收獲后水果貯存期的病害[1]。我國(guó)自20世紀(jì)90年代開始對(duì)咪鮮胺進(jìn)行廣泛的藥效試驗(yàn),其對(duì)花生褐斑病、油菜菌核病、茶炭疽病等都有明顯的防效,且用量較低[2]。稻瘟酰胺(fenoxanil)化學(xué)名稱:N-(1-氰基-1,2-二甲基丙基)-2-(2,4-二氯苯氧基)丙酰胺,屬黑色素生物合成抑制劑[3]。稻瘟酰胺是一種用于防治水稻稻瘟病的苯氧酰胺類殺菌劑[4],作用機(jī)制新穎,在葉面和水下施用時(shí)防治稻瘟病效果極佳。25%咪鮮胺·稻瘟酰胺囊懸浮-懸浮劑對(duì)水稻稻瘟病有較好的防治效果[5]。咪鮮胺和稻瘟酰胺單劑的分析方法已有報(bào)道,但兩者復(fù)配劑型的分析方法未見報(bào)道[6]。本文采用高效液相色譜的反相法對(duì)25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑進(jìn)行了測(cè)定,旨在探索檢測(cè)咪鮮胺和稻瘟酰胺復(fù)配制劑的理論方法。
1260高效液相色譜儀,具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,帶自動(dòng)進(jìn)樣裝置和色譜數(shù)據(jù)處理工作站,美國(guó)安捷倫公司;過濾器:濾膜孔徑0.45 μm。
乙腈,色譜純;冰乙酸,分析純;水,新蒸二次蒸餾水;咪鮮胺標(biāo)樣(≥98.0%)、稻瘟酰胺標(biāo)樣(≥98.0%)、25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑(15%咪鮮胺+10%稻瘟酰胺),北京明德立達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司。
色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;流動(dòng)相:乙腈+0.3%冰乙酸水溶液(體積比為72∶28);流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量:5 μL,柱溫:23~27℃。
在上述色譜操作條件下,咪鮮胺的保留時(shí)間約為5.1 min;稻瘟酰胺的保留時(shí)間約為6.1 min(圖1、圖2)。
圖1 咪鮮胺、稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖
圖2 25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑的高效液相色譜圖
1.4.1 標(biāo)樣溶液的配制
稱取含咪鮮胺0.015 g、稻瘟酰胺0.010 g的標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 02 g),置于同一50 mL的容量瓶中,加入適量的乙腈溶解,超聲脫氣10 min,使標(biāo)樣全部溶解,冷至室溫后,用流動(dòng)相定容、搖勻后備用。
1.4.2 試樣溶液的配制
稱取咪鮮胺0.015 g、稻瘟酰胺0.010 g(精確至0.000 02 g),置于50 mL容量瓶中,加入適量乙腈溶解,并超聲脫氣10 min,使試樣全部溶解,冷卻至室溫,用流動(dòng)相定容、搖勻后,用孔徑為0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾后備用。
按以上色譜操作條件,待儀器基線穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液,計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值,直至相鄰兩針咪鮮胺(稻瘟酰胺)響應(yīng)值相對(duì)變化小于1.5%時(shí),按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。用外標(biāo)法計(jì)算各自含量。
將測(cè)得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中的咪鮮胺(稻瘟酰胺)峰面積分別進(jìn)行平均。被試物中各檢測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(%)按式(1)計(jì)算。
式中:A1為標(biāo)樣溶液中咪鮮胺(稻瘟酰胺)峰面積平均值,mAU·s;A2為試樣溶液中咪鮮胺(稻瘟酰胺)峰面積平均值,mAU·s;m1為標(biāo)樣溶液中咪鮮胺(稻瘟酰胺)的質(zhì)量,g;m2為試樣的質(zhì)量,g;P為標(biāo)樣中咪鮮胺(稻瘟酰胺)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。
檢測(cè)波長(zhǎng)是影響紫外吸收的因素,波長(zhǎng)的選擇決定峰面積和峰高的大小。分別對(duì)咪鮮胺和稻瘟酰胺標(biāo)樣溶液進(jìn)行紫外掃描,得到相應(yīng)的吸收波長(zhǎng)。咪鮮胺和稻瘟酰胺在200 nm附近均有最大紫外吸收,但稻瘟酰胺在230 nm處還有一較大紫外吸收,而且在200 nm的波長(zhǎng)下雜質(zhì)的響應(yīng)值較多,對(duì)咪鮮胺和稻瘟酰胺會(huì)有一定的干擾,綜合多種因素考慮,最終決定咪鮮胺、稻瘟酰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。兩者紫外吸收光譜圖見圖3。
圖3 咪鮮胺和稻瘟酰胺紫外掃描圖
經(jīng)過多次試驗(yàn),分別以甲醇+水和乙腈+水及甲醇+冰乙酸水溶液和乙腈+冰乙酸水溶液等的配比作為流動(dòng)相進(jìn)行,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈+0.3%冰乙酸水溶液(體積比為72∶28)作為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min時(shí),分離效果好,出峰時(shí)間短,且峰形較尖銳、對(duì)稱。綜合以上因素,最終選定乙腈+0.3%冰乙酸水溶液(體積比為72∶28)作為流動(dòng)相。
稱取咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品約0.077 16 g、稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)品約0.050 36 g置于同一50 mL容量瓶中,用適量乙腈溶解、流動(dòng)相定容,用移液管分別量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL溶液于6個(gè)10 mL容量瓶中,乙腈定容,配制咪鮮胺、稻瘟酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。待儀器穩(wěn)定后,在上述色譜條件下,按濃度從低到高的順序進(jìn)樣,每個(gè)濃度進(jìn)樣兩次。以進(jìn)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得咪鮮胺線性方程y=9.639 6x-9.304 7,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2,表明線性關(guān)系良好(圖4);稻瘟酰胺線性方程y=9.580 1x-38.785 4,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4,表明線性關(guān)系良好(圖5)。
選取一個(gè)有代表性的25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑試樣,在上述色譜操作條件下,對(duì)其有效成分(咪鮮胺、稻瘟酰胺)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表1。由表1可見咪鮮胺和稻瘟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.14和0.08,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.93%和0.81%,表明該方法的精密度好。
在已知含量的樣品中加入不同質(zhì)量的咪鮮胺、稻瘟酰胺的標(biāo)樣,按上述色譜操作條件進(jìn)行5次測(cè)定,計(jì)算其各自回收率,結(jié)果見表2。咪鮮胺平均回收率為99.72%;稻瘟酰胺平均回收率為99.36%,表明此方法具有較高的準(zhǔn)確度。
圖4 咪鮮胺線性關(guān)系圖
圖5 稻瘟酰胺線性關(guān)系圖
表1 25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑精密度測(cè)定
表2 25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑準(zhǔn)確度測(cè)定
本文提出了25%咪鮮胺·稻瘟酰胺微囊懸浮-懸浮劑中有效成分咪鮮胺、稻瘟酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜分析方法,該方法既可以檢測(cè)咪鮮胺與稻瘟酰胺的復(fù)配劑型的制劑,還可以檢測(cè)咪鮮胺、稻瘟酰胺單個(gè)劑型的制劑,也適用于咪鮮胺、稻瘟酰胺原藥的檢測(cè)。此方法具有操作容易、速度快、分離好的優(yōu)點(diǎn),精密度和準(zhǔn)確度較高,是咪鮮胺和稻瘟酰胺復(fù)配制劑檢測(cè)的理想方法。