張維嬌 金學榮 徐雅晴 李江華 堵國成 康振

（江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

枯草芽孢桿菌與真核系統(tǒng)相比具有生長快，發(fā)酵周期短且易于培養(yǎng)等優(yōu)勢；與其他原核系統(tǒng)相比具有較強的分泌表達能力［1-2］，能有效避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累和不溶性包涵體的形成，其遺傳背景清晰，被認為是下一代超高效分泌的細胞工廠［3］并具有開發(fā)成底盤細胞的潛力［4］。

利用傳統(tǒng)的代謝工程手段可以實現(xiàn)一定時間內(nèi)目的產(chǎn)物的積累，但是由于局部途徑的過表達，往往會造成細胞代謝流的失衡［5］。如何平衡細胞的生長與產(chǎn)物的高效合成是代謝工程的一個重要問題［6］。微生物代謝流的分配在生長過程中并非一成不變，而是隨著胞內(nèi)代謝物水平及環(huán)境的變化而發(fā)生動態(tài)調(diào)整。動態(tài)調(diào)控手段能在保證目的產(chǎn)物高效合成的情況下，同時平衡細胞的生長，實現(xiàn)高產(chǎn)量和高底物轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)一。

本文主要從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上綜述了近幾年來枯草芽孢桿菌動態(tài)表達調(diào)控工具的開發(fā)，并就其調(diào)控機制進行了介紹，最后對這些調(diào)控工具在產(chǎn)物合成中的應用做了簡要概述。

1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

目的基因表達的第一步就是轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄水平上進行基因表達調(diào)控是最直接和最方便的?；虻霓D(zhuǎn)錄過程通常與外界物質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、胞內(nèi)代謝物以及群體環(huán)境等相關［7］，通過控制這些影響因子可以實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

1.1 基于誘導型啟動子的調(diào)控

與組成型啟動子相比，誘導型啟動子具有可以人為控制基因轉(zhuǎn)錄的開啟或者關閉等獨特優(yōu)勢，從而有效地應用于基因的調(diào)控表達。近幾年來，多種類型的誘導型啟動子被開發(fā)，應用于代謝調(diào)控中。常見的誘導型啟動子有Pgrac（IPTG 誘導）、PspaS（枯草菌素誘導）、PxylA（木糖誘導）、Pglv（麥芽糖誘導）和PsacB（蔗糖誘導），這些啟動子已被普遍用于產(chǎn)物的代謝調(diào)控［8］。Jiao 等［9］將啟動子PgroE和PsacB融合構(gòu)建了蔗糖誘導型啟動子Pg1，同時將PgroE與lacO融合構(gòu)建了IPTG 誘導型啟動子Pg2，并進一步通過在-35 與-10 區(qū)域進行突變獲得啟動子Pg3，最終使表面活性素高達9.74 g/L。為實現(xiàn)多個基因的表達調(diào)控，Zhou 等［10］將來源于巨大芽孢桿菌的PxylA木糖誘導啟動子和來源于大腸的IPTG誘導型啟動子Pgrac組合生產(chǎn)紫穗槐二烯，成功實現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的調(diào)控。最近，Toymentseva等［11］開發(fā)了基于lial啟動子的LIKE 系統(tǒng)，其相似于乳酸菌NICE 系統(tǒng)［12］和枯草芽孢桿菌SURE 系統(tǒng)［13］，其能嚴格調(diào)控基因表達，在非誘導條件下緊密關閉啟動子。

考慮到誘導劑的補充和發(fā)酵過程的簡化性，環(huán)境誘導型啟動子也逐漸被開發(fā)。Welsch 等［14］通過將des啟動子與冷休克蛋白cspB基因的下游表達框或5'-UTR 莖環(huán)結(jié)構(gòu)融合構(gòu)建成冷誘導啟動子，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，只需要通過溫度的控制即可以實現(xiàn)對木聚糖酶表達的調(diào)控。Li 等［15］從枯草芽孢桿菌中分離和鑒定了兩個溫度敏感型啟動子，構(gòu)建了有效的溫度誘導型表達系統(tǒng)。此外，還有一些環(huán)境依賴型的啟動子，Yang 等［16］選擇了枯草芽孢桿菌114 個內(nèi)源啟動子，以綠色熒光蛋白（GFP）為報告基因，分別對不同的溫度和pH 條件下啟動子的表達強度進行了表征，通過將不同表達時期的啟動子組合可以實現(xiàn)脂酶、角蛋白酶和堿性果膠酶的差異性表達。

1.2 基于核糖開關介導的表達調(diào)控

2002 年核糖開關（Riboswitch）在細菌中被發(fā) 現(xiàn)，Riboswitch 是mRNA上的一段5'非翻譯區(qū)（5'UTR），包括核糖體結(jié)合位點（RBS）、操縱基因等元件，大多數(shù)核糖開關由適體和表達平臺兩個部分組成。適體是其RNA 元件最保守的部分，可以與特定的小分子代謝物結(jié)合誘發(fā)mRNA 變構(gòu)，表達平臺作為遺傳控制元件將適體中的折疊變化轉(zhuǎn)化為基因表達的變化。

Riboswitch 主要有4 種調(diào)控形式，分別為轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的抑制和激活調(diào)控，如圖1 所示。在轉(zhuǎn)錄水平，若適體未結(jié)合配體之前處于打開狀態(tài)，與配體結(jié)合后會使表達平臺形成不依賴ρ 因子（poly U）或依賴ρ 因子（rho）的終止結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為關閉狀態(tài)，從而導致轉(zhuǎn)錄終止，如枯草芽孢桿菌的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）riboswitch［17］、賴氨酸（lysC）riboswitch［18］和yitJ riboswitch［19］都屬于這類調(diào)控方式。然而與之調(diào)控機制相反的腺嘌呤（pbuE）riboswitch［20］，當在胞內(nèi)存在高濃度的腺嘌呤時，腺嘌呤的結(jié)合可穩(wěn)定核糖開關的適體結(jié)構(gòu)域充當抗終止元件，從而導致下游基因的表達上調(diào)。大多數(shù)核糖開關可分為適體和表達平臺兩個結(jié)構(gòu)域，而甘氨酸核糖開關［21］存在兩個類似適體的配體結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域以一個短的保守序列連接，與配體結(jié)合后激活基因的表達，這種獨特結(jié)構(gòu)需確保過量的甘氨酸提供檸檬酸循環(huán)中的碳通量，當甘氨酸濃度減小時，核糖開關會快速關閉并保持足夠量的氨基酸用于蛋白質(zhì)合成［22］。除此之外，翻譯水平的riboswitch 將在下文進行介紹。

1.3 基于群體感應的表達調(diào)控

群體感應（Quorum sensing，QS）是細菌細胞間通訊的一種形式［23］，多存在革蘭氏陰性菌中，主要是通過響應細胞密度進行基因的表達調(diào)控，該過程的調(diào)控途徑是復雜的，需要多個酶和轉(zhuǎn)錄因子的共同作用。依賴于細胞密度調(diào)控的電路主要由誘導分子和受體蛋白兩部分組成，誘導分子與受體結(jié)合激活靶基因，靶基因在細菌中發(fā)揮必要的功能，QS 系統(tǒng)可以動態(tài)平衡目標產(chǎn)物的有效合成與細胞生長之間的關系。

圖1 核糖開關調(diào)控基因表達的機理

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均存在QS 系統(tǒng)，革蘭氏陰性菌的QS 系統(tǒng)已經(jīng)得到了很好的開發(fā)［24］，目前在枯草芽孢桿菌中存在的QS 主要有ComPComA系統(tǒng)［25］和Phr-Rap系統(tǒng)［26］，Phr60-Rap60-Spo0A 系統(tǒng)是枯草芽孢桿菌中研究較多的群體感應系統(tǒng)，Spo0A 是孢子形成的主要調(diào)節(jié)劑，必須磷酸化才能發(fā)揮活性。此外，隨著細胞的生長，細胞密度的增加會促使Phr60 增加［27］，并通過Opp 轉(zhuǎn)運體進入細胞，而Phr60 抑制Rap60 的活性，Rap60 通過調(diào)節(jié)磷酸化基來負調(diào)控Spo0A 的活性，從而激活Spo0A 調(diào)控基因的表達。其QS 調(diào)控途徑如圖2 所示，Cui 等［28］利用Phr60-Rap60-Spo0A 系統(tǒng)構(gòu)建了雙功能表達的分子開關，通過增加前體磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和庚二烯二磷酸（HDP）的供應，以改善甲基萘醌-7（MK-7）的合成。Spo0A 抑制pyk和uppS 的表達導致從PEP 到TCA 途徑代謝通量受到限制，IPP 的消耗減少，在后期階段因為丙酮酸的生成，細胞生長迅速下降，其最終MK-7 的產(chǎn)量增加，Spo0A 上調(diào)ispH 和hepS/T 的表達，將碳通量推向MK-7 合成途徑，動態(tài)平衡有毒物質(zhì)HMBPP 和DMAPP 對細胞生長的影響。Boguslawski 等［29］確定了Rap 蛋白調(diào)節(jié)ComA 活性的新機制，提出了Rap60 結(jié)合ComA 并抑制其活性，而不會干擾ComA與DNA 的結(jié)合的新研究。Wolf 等［30］分析了ComA激活基因的轉(zhuǎn)錄機制，通過對比rapA，rapC，srfAA和lutP 等啟動子序列發(fā)現(xiàn)ComA 除了結(jié)合反向重復序列（Inverted repeat，IR），還會結(jié)合直接重復序列（Direct repeat，DR），并以熒光為報告基因驗證了DR 是ComA 與啟動子結(jié)合的功能序列，同時利用凝膠電泳表明ComA 是通過與α 亞基相互作用而促進RNAP 募集到啟動子的過程。但ComP-ComA 系統(tǒng)還未見在代謝調(diào)控中的應用。

圖2 QS 調(diào)控系統(tǒng)原理圖

2 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控

轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控是在mRNA水平上進行的調(diào)控，主要有小RNA（small ribonucleic acids，sRNAs）、 Riboswitch 和CRISPR 系統(tǒng)。

2.1 基于sRNAs介導的表達調(diào)控

sRNAs 是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在枯草芽孢桿菌中目前預測和鑒定的sRNAs 一共有108 個［31］，sRNAs 通過與mRNA 堿基互補配對可改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)并激活或抑制翻譯，從調(diào)節(jié)方式上可分為順式作用（trans-encoded）和反式作用（cis- encoded）。FsrA 是枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)的第一個transencoded RNAs，其參與鐵代謝相關的靶標mRNA，同時需要伴侶蛋白FbpA、FbpB 和FbpC［32］的參與。SR1 是枯草芽孢桿菌第一個雙功能的sRNAs，一方面可以與靶標ahrC 的mRNA 堿基配對抑制翻譯，還參與精氨酸的分解代謝［33］；另一方面也可以充當編碼肽SR1P 的mRNA。SR1P 與糖酵解酶GapA 形成GapA/SR1P 復合物并與RNase J1 相互作用，從而促進RNase J1 目標的降解［34］。

Cis-encoded RNAs 一般存在毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin）系統(tǒng)中，毒素基因編碼一個有毒性蛋白，抗毒素基因轉(zhuǎn)錄的sRNAs 與毒素基因形成sRNAsmRNA 配對復合物，從而抑制翻譯和影響mRNA 的穩(wěn)定性。Yang 等［35］以GFP 為報告基因，通過對TypeI毒素-抗毒素bsrG/sr4進行優(yōu)化，構(gòu)建了MSDOS（Modulation via the sRNA-dependent operation system）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表達系統(tǒng)，其調(diào)控機理如圖3 所示，將MS-DOS 系統(tǒng)應用于透明質(zhì)酸（HA）合成過程中，發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)參與磷酸戊糖徑途、糖酵解途徑和細胞壁多糖合成的9 種基因，其抑制zwf、pfkA和galE基因表現(xiàn)了對HA 合成明顯的積極影響，基因pfkA的下調(diào)使得HA 的最高產(chǎn)量達1.52 g/L，是原始菌株的1.6 倍。編碼6-磷酸果糖激酶的pfkA基因是糖酵解途徑中的關鍵酶，pfkA失活會引起嚴重的生長缺陷［36］。應用MS-DOS，可以在任何指定的時間點通過添加IPTG 抑制pfkA 基因，以協(xié)調(diào)細胞生長和HA 的合成，此處MS-DOS 僅通過引入單個RNAsr4即可實現(xiàn)多個基因的同時精確抑制，這與其他報道的干擾系統(tǒng)完全不同。為進一步促進枯草芽孢桿菌的應用，Yang 等［37］構(gòu)建了新型、穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌食品級表達系統(tǒng)（Type Ⅱ毒素-抗毒素系統(tǒng)ydcD/ydcE），該系統(tǒng)在不添加抗生素的條件下，菌株傳代100 后質(zhì)粒仍然穩(wěn)定存在，利用該系統(tǒng)將透明質(zhì)酸合酶構(gòu)建于HA 合成途徑中，同對照相比，獲得了更大的生物量（OD600）和更高的HA產(chǎn)量0.6 g/L，與由抗生素維持的常用表達系統(tǒng)相比，該新型表達系統(tǒng)消除了代謝負擔并促進了細胞生長。類似的txpA/ratA和bsrE/sr5毒素-抗毒素系統(tǒng)也通過影響mRNA 降解的機制達到調(diào)控基因的目的［38］。

2.2 基于Riboswitch表達調(diào)控

Riboswitch 一方面是通過對RBS 序列遮蔽和暴露進行調(diào)控，枯草芽孢桿菌yjdF riboswitch［39］處于關閉狀態(tài)，與RBS 區(qū)域配對遮蔽RBS 序列，導致翻譯被抑制；其與配體結(jié)合后表達平臺的莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，RBS 區(qū)域被暴露出來進而激活下游基因的表達。許多細菌的mRNA 翻譯起始取決于同核糖體結(jié)合的RBS 與起始密碼子的距離［40］，Suess 等［41］創(chuàng)建了一種新型的茶堿核糖開關，通過在距離RBS不同位置處插入莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該元件可干擾核糖體結(jié)合并能將其位置可逆地移動1 nt，配體茶堿結(jié)合后誘導結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，并調(diào)整合適的核糖體結(jié)合位點。

圖3 bsrG/sr4 毒素-抗毒素系統(tǒng)原理圖

Riboswitch 還可以通過對mRNA 的穩(wěn)定性進行基因的表達調(diào)控，通常與胞內(nèi)代謝物的濃度相關?？莶菅挎邨U菌glmS核酶riboswitch［42］，如圖4 所示，其與代謝物6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN6P）發(fā)生響應，當細胞中過量積累GlcN6P 時glmS核酶將被激活，在5'位點附近發(fā)生自催化特異性裂解，從而導致glmSmRNA 不穩(wěn)定和表達量降低。Klein 等［43］證實了在glmS核酶第40 位發(fā)現(xiàn)了重要的鳥嘌呤（G）位點，將其突變?yōu)橄汆堰剩ˋ）后消除了glmS核酶的催化作用。Winkler 等［44］進一步對glmS核酶進行了一系列突變，其中將裂解位點AG 突變?yōu)镃C 的M9 突變體顯示了20 倍以上的β-半乳糖苷酶活性，表明glmS核酶活性被抑制。根據(jù)這一原理，Niu 等［45］設計了GlcN6P 響應性glmS核酶開關，動態(tài)控制GlcN6P 供應和消耗所涉及的pgi、pfkA和glmM基因的表達，使得GlcNAc 的產(chǎn)量可達16.26 g/L，形成了GlcNAc 合成途徑、肽聚糖合成途徑（PSP）、糖酵解途徑（EMP）和磷酸戊糖途徑（HMP）之間的代謝平衡，細胞內(nèi)GlcN6P 濃度的水平影響代謝途徑中關鍵酶的活性調(diào)節(jié)，其可以形成反饋路徑，動態(tài)的平衡細胞生長和GlcNAc 的合成，減少了副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)生。這一glmS核糖開關的調(diào)控機制在釀酒酵母和大腸桿菌中也普遍進行了研究。

圖4 glms mRNA 的失穩(wěn)機制

2.3 基于CRISPR系統(tǒng)的表達調(diào)控

CRISPR 系統(tǒng)由核酸內(nèi)切酶Cas9 和sgRNA（single-guide RNA）兩部分組成，這個sgRNA 可以幫助Cas9 定位到目標序列，從而對 DNA 序列進行定點切割，PAM 基序（Proto-spacer adjacent motifs）有利于識別目的序列的位點，位于切割序列的下游。CRISPR系統(tǒng)調(diào)控可分 為CRISPRi（CRISPR inhibition）和CRISPRa（CRISPR activator）［46］，如圖5 所示，Cas9 的D10A 和H840A 位點突變形成失活的dCas9（deactivated Cas9），該突變體缺乏核酸內(nèi)切酶活性，保留了結(jié)合DNA 的活性［47］，將dCas9定位到靶序列會阻礙基因的轉(zhuǎn)錄，而與激活因子結(jié)合后可以募集RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNAP），促進基因的轉(zhuǎn)錄。

Wang 等［48］為了提高枯草芽孢桿菌中表面活性素的產(chǎn)生，使用CRISPRi 技術分別抑制了氨基酸生物合成分支代謝途徑上的20 個基因，由于細胞會將能量從生長轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)，因此高生產(chǎn)率可能會降低細胞生長，然而，其中對單基因yrpC、racE的抑制表現(xiàn)了更高的細胞生物量和較高的表面活性素產(chǎn)量，因為其具有高的底物利用速率。在枯草芽孢桿菌中，由Pxyl啟動子介導的dCas9 表達比其他啟動子具有更高的抑制效率［49］，Wu 等［50］開發(fā)了一種基于木糖誘導的枯草芽孢桿菌CRISPRi 系統(tǒng)，當抑制PSP 中的glmM時，較高的碳通量被導向EMP，對EMP 中pfkA基因抑制可以緩解碳溢出，基因zwf表達被抑制，其利用葡萄糖量減少而木糖增多，說明zwf的缺失抑制了葡萄糖流入HMP，導致大量碳通量導向EMP，同時對PSP、EMP 和HMP 這三個途徑進行抑制，可以減少葡萄糖分解代謝并促進木糖的利用，使GlcNAc 產(chǎn)量提高了13.2%。Westbrook等［51］通過CRISPRi 減少pfkA和zwf的表達從而減少中間代謝碳的流失，可以將碳通量分別從EMP 和HMP 途徑重新定向到細胞壁的生物合成，并通過適當調(diào)節(jié)pfkA和zwf的抑制強度可以顯著提高HA的產(chǎn)生，而不會影響HA 的分子量，同時對細胞生理的影響較小。研究發(fā)現(xiàn)RNAP 的ω 亞基與啟動子上游區(qū)域的dCas9 融合可以實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄激活（CRISPRa）［52］，最近，Lu 等［53］首次在枯草芽孢桿菌中應用CRISPRa 系統(tǒng)，dCas9-α/ω 介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控高度依賴靶位，因此可以通過設計特定的sgRNA來同時激活和抑制不同基因的表達，結(jié)合dCas9-ω介導的轉(zhuǎn)錄和新型啟動子工程OAPS（Oligonucleotide annealing based promoter shuffling），枯草芽孢桿菌中淀粉酶的產(chǎn)量增加了260 倍。

圖5 CRISPRi 和CRISPRa 調(diào)控機理

3 總結(jié)與展望

枯草芽孢桿菌的動態(tài)調(diào)控工具可以有效的平衡代謝產(chǎn)物的合成和細胞的自身生長，從而維持代謝網(wǎng)絡的穩(wěn)定，避免了細胞受損、中間代謝物積累以及產(chǎn)量低等問題?？莶菅挎邨U菌中的動態(tài)調(diào)控可以通過誘導物的添加、QS 系統(tǒng)的響應影響基因的轉(zhuǎn)錄，也可以利用sRNAs、Riboswitch 和CRISPR 調(diào)控基因的翻譯水平。

然而目前枯草芽孢桿菌的動態(tài)調(diào)控工具仍然缺乏，且天然的sRNAs、QS 系統(tǒng)、Riboswitch 代謝因子響應范圍較窄、調(diào)控元件數(shù)量不多、調(diào)控機理不清晰，而基于對細胞代謝全局調(diào)控需求的增加，開發(fā)更多的調(diào)控工具去維持枯草芽孢桿菌的動態(tài)平衡是有必要的。一方面可以進一步鑒定枯草芽孢桿菌自身代謝物響應的轉(zhuǎn)錄因子、Riboswitch、sRNAs 等有關遺傳調(diào)控元件，挖掘更多的枯草芽孢桿菌自身調(diào)控機制，明確產(chǎn)物合成的磷酸戊糖徑途、糖酵解途徑、碳通量流向等代謝網(wǎng)絡信息，從而賦予枯草芽孢桿菌更好的動態(tài)調(diào)控能力；另一方面基于不斷發(fā)展的系統(tǒng)生物學和合成生物學技術，可以定向設計目標啟動子、分析特定的核糖體結(jié)合位點、改造sRNAs 的功能結(jié)構(gòu)等組合控制基因表達。加之高通量技術的應用，更多潛在的調(diào)控元件將會被更加高效地篩選出來，大量遺傳調(diào)控元件被開發(fā)，大大加快了微生物細胞工廠的構(gòu)建。隨著生物技術的發(fā)展，枯草芽孢桿菌底盤細胞的潛力逐漸被呈現(xiàn)出來，其底盤細胞是通過基因組最小化、碳分解代謝物阻遏去除、細胞膜工程和蛋白質(zhì)分泌途徑工程獲得的，將動態(tài)調(diào)控工具與人工底盤細胞結(jié)合應用可以更加針對性的對目標途徑進行動態(tài)調(diào)控及機制解析。