張麗珊 孫莉娜 林鎮(zhèn)平 林向民

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

隨著全球人口的增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖正成為人類飲食中魚蛋白的主要來源。然而，伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚類的各種傳染性疾病也日益嚴(yán)重［1-2］。常見的水產(chǎn)致病菌有嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌等，可引起出血性敗血癥［3］。這些疾病的爆發(fā)與傳播給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的損失也越來越嚴(yán)重。為了防治水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的感染性疾病，大量的抗生素（慶大霉素、利福平、四環(huán)素等）被投入使用，而抗生素濫用使得細(xì)菌的耐藥性日益嚴(yán)峻，耐藥菌株層出不斷，同時(shí)也伴隨著環(huán)境中藥物殘留污染的現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重［4-5］。因此，探究其致病機(jī)制被認(rèn)為是控制水生病原體感染最有效的途徑之一。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）作為水體中一種常見的致病菌，能產(chǎn)生腸細(xì)胞毒素、溶血素、蛋白酶和血凝素等毒力因子，引發(fā)魚類患出血性敗血癥［6］。在體內(nèi)，鐵通常由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)而被氧化成不溶形式，并與細(xì)胞內(nèi)的血紅素、鐵蛋白、血紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，因此細(xì)菌不易獲得［7］。為了應(yīng)對(duì)這種鐵缺乏癥，微生物已經(jīng)進(jìn)化出一系列復(fù)雜的機(jī)制來與宿主競(jìng)爭(zhēng)，例如鐵載體的分泌，以從轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白和鐵蛋白中捕獲鐵并維持鐵動(dòng)態(tài)平衡以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)、增殖和毒素分泌［8］。非核糖體肽是一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，通常在細(xì)菌和真菌等微生物中產(chǎn)生。與在核糖體上合成的多肽不同，非核糖體肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）由相互獨(dú)立的多個(gè)模塊組成，模塊具有的特異結(jié)構(gòu)域及酶活，催化相鄰兩模塊上供體多肽和受體氨基酸的肽鍵形成［9-10］。作為次生代謝產(chǎn)物，NRP 可以產(chǎn)生比核糖體更廣泛的多肽。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上是一個(gè)非常多樣化的天然產(chǎn)物家族，具有極其廣泛的生物活性和藥理學(xué)特性，可被用作激素、抗生素、鐵載體、抗真菌、抗癌等豐富多樣的生物活性［11］。微生物鐵載體在人類，動(dòng)物和植物的可持續(xù)性方面的應(yīng)用范圍很廣?；诜呛颂求w肽作為鐵載體時(shí)在各個(gè)方面的有益應(yīng)用，如細(xì)菌利用合成的鐵載體攫取外界游離Fe3+來維持正常的生理活動(dòng)。在嗜水氣單胞菌ATCC7966 基因組中AHA_2473-AHA_2479是一個(gè)反映鐵載體的生物合成和調(diào)節(jié)的基因簇，在這個(gè)基因簇中AHA_2474、AHA_2476是兩個(gè)編碼非核糖體肽合成酶的基因，目前對(duì)于這兩個(gè)基因功能的研究比較少。本研究通過同源重組方法構(gòu)建嗜水氣單胞菌AHA_2474（nonribosomal peptide synthetase）、AHA_2476（nonribosomal peptide synthetase）基因缺失菌株（ΔAHA_2474、ΔAHA_2476），利用Chrome azurol sulfonate（CAS）檢測(cè)法對(duì)缺失菌產(chǎn)鐵情況進(jìn)行測(cè)定，并利用M9 限制性培養(yǎng)基觀察及補(bǔ)充鐵的條件下野生菌和缺失菌的生長(zhǎng)情況，最后通過DIP 條件下測(cè)生長(zhǎng)曲線及測(cè)定溶血性、胞外蛋白酶活性、過氧化氫耐受性比較AHA_2474、AHA_2476基因的缺失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，分析AHA_2474、AHA_2476的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制，為更好地認(rèn)識(shí)細(xì)菌生理功能調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)［6，12］。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的嗜水氣單胞菌ATCC7966、大腸桿菌（MC1061、S17）及質(zhì)粒（pRE112）均保存在本實(shí)驗(yàn)室中，除嗜水氣單胞菌培養(yǎng)在30℃，其余都培養(yǎng)在37℃的LB 培養(yǎng)基中；LB 培養(yǎng)基成分：胰蛋白酶胨、酵母粉、氯化鈉均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa 公司，連接酶購(gòu)于諾唯贊生物公司，Taq 酶購(gòu)于翊圣生物科技有限公司，無菌脫纖維綿羊血、脫脂牛奶購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建缺失菌株 利用與自殺載體pRE112 同源重組原理，以嗜水氣單胞菌ATCC7966 的基因組DNA 為模板構(gòu)建兩側(cè)為AHA_2474、AHA_2476基因上、下游同源序列片段的基因敲除質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌MC1061 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR 驗(yàn)證正確后提取質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17感受態(tài)細(xì)胞，再經(jīng)菌液PCR 驗(yàn)證正確后利用接合法與野生株（wild type，WT）同源重組，通過100 μg/mL 氨芐青霉素、30 μg/mL 氯霉素抗性篩選，獲得第一次同源重組菌株之后在含有20%蔗糖的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次同源重組，經(jīng)氯霉素抗性平板篩選、菌液PCR 和DNA 測(cè)序確認(rèn)嗜水氣單胞菌AHA_2474、AHA_2476基因缺失突變株。最后通過穩(wěn)定遺傳20 代后，測(cè)序正確后保菌在-80℃冰箱中。

1.2.2 菌株培養(yǎng) 表型驗(yàn)證的菌株均從LB 平板上分別挑取野生株、ΔAHA_2474和ΔAHA_2476單一菌落接種于5 mL LB 培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)16h至穩(wěn)定狀態(tài)。取過夜菌按1∶100 比例轉(zhuǎn)接至5 mL 新鮮 LB 中，30℃，200 r/min，搖至OD=1.0后使用。

1.2.3 溶血性和胞外蛋白酶活性 將OD=1.0 的野生株、ΔAHA_2474和ΔAHA_2476各取5 μL 接種于已打孔的綿羊血平板（綿羊血含7%）和脫脂牛奶平板（脫脂牛奶含1%）上，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-18 h，觀察溶血圈和水解圈的大小，測(cè)量圈的大小以及拍照保存，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.2.4 ΔAHA_2474、ΔAHA_2476突變株在DIP條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將OD=1.0 的野生株、ΔAHA_2474和ΔAHA_2476按1∶100加入1 mL LB培養(yǎng)基中并加入終濃度為200 μmol/L 鐵離子螯合劑2，2'-聯(lián)吡啶（DIP），最后以每孔300 μL 加入微孔板中，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組均做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，放入30℃、波長(zhǎng)600 nm 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中，測(cè)定16 h，每小時(shí)測(cè)定一次吸光值。

1.2.5 CAS 檢測(cè)液測(cè)定 配制CAS 檢測(cè)液：（1）配制CAS 染色液，溶液A：將0.079g的鉻天青（CAS，上海試劑公司）溶于50 mL 去離子水中，再加入10 mL 1mmol/L 的FeCl3溶液（含有10 mmol/L 的HCl）；溶液B：將0.069g的十六烷基三甲基溴化銨（HDTMA）溶于40 mL 的去離子水中；溶液C：將A 溶液沿著燒杯的壁緩緩加入到B 溶液中，輕輕晃動(dòng)，使溶液AB 混勻，得到溶液C：CAS 染色液，121℃滅菌15 min。（2）配制0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8），121℃滅菌15 min，使用時(shí)稀釋10 倍。（3）配制CAS 培養(yǎng)基：先配制好1 mmol/L 的CaCl2溶 液、1 mmol/L 的MgSO4·7H2O溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液、20%蔗糖；再分別取0.1 mL 的CaCl2溶液、2 mL 的MgSO4·7H2O溶液、3 mL 的10%的酸水解酪蛋白溶液，20%蔗糖1 mL，去離子水定容到100 mL，115℃滅菌15 min。當(dāng)以上的培養(yǎng)基滅完菌后，溫度降低到60℃時(shí)，加入稀釋好的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液5 mL 及8 mL CAS 染色液，每100 mL CAS 培養(yǎng)基的量沿著三角瓶壁加入，混合均勻后取5 mL 分裝至已滅菌的試管中。將OD=1.0 的野生株、ΔAHA_2474和ΔAHA_2476菌株按1∶100 轉(zhuǎn)接至分裝好CAS 試管中，30℃，200 r/min 搖床中培養(yǎng)16h后觀察生長(zhǎng)狀況并拍照保存。

1.2.6 M9 限制性培養(yǎng)基測(cè)定 配制M9 限制性培養(yǎng)基：5×M9 鹽溶液（Na2HPO4·7H2O 0.678 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.05 g，NH4Cl 0.1 g）20 mL、20%葡萄糖2 mL、1 mol/L MgSO4200 μL、1 mol/L CaCl210 μL，加入蒸餾水補(bǔ)足100 mL，并且每100 mL 加入1.8g瓊脂粉，121℃，滅菌15 min 后，倒在培養(yǎng)皿中。分別制備LB 平板，M9 平板及加有終濃度為50 μg/mL FeCl3的M9 平板，將OD=1.0 的野生株、ΔAHA_2474、ΔAHA_2476分別取2 μL 劃在平板中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后觀察其生長(zhǎng)狀況并拍照保存，并重復(fù)3 次。

1.2.7 對(duì)過氧化物的耐受性測(cè)定 將OD=1.0 的野生株、ΔAHA_2474、ΔAHA_2476按1%的比例將菌體加入到1 mL 液體LB 中，實(shí)驗(yàn)組加入稀釋5 倍的H2O2，使其作用濃度為2.5 mmol/L，對(duì)照組不作處理，室溫應(yīng)激10 min 后對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋（10-2-10-7），對(duì)每個(gè)稀釋梯度的樣品各取2 μL 點(diǎn)板接種于LB 瓊脂平板上；30℃培養(yǎng)12-16h后觀察結(jié)果并拍照保存實(shí)驗(yàn)記錄，實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 非核糖體肽合成酶基因敲除

利用軟件CE、Design.V1.03 及NCBI 數(shù)據(jù)庫在目的基因上下游各500 bp 設(shè)計(jì)引物分別為P1P2、P3P4（表1），之后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過多片段連接酶無縫連接到pRE112 載體上再分別轉(zhuǎn)入MC1061、S17 感受態(tài)中，再經(jīng)同源重組和含20%蔗糖的LB 平板篩選及氯霉素抗性篩選，獲得AHA_2474、AHA_2476敲除菌株，通過目的基因兩端引物P5P6，P1 上游和P4 下游100 bp 左右設(shè)計(jì)引物P7P8 進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證，并以野生株為對(duì)照獲得敲除菌ΔAHA_2474、ΔAHA_2476（圖1）。

2.2 ΔAHA_2474、ΔAHA_2476對(duì)胞外蛋白酶活性與溶血性的影響

胞外蛋白酶和外毒素是嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的兩大毒力因子，毒力因子的存在導(dǎo)致了嗜水氣單胞菌的致病性，嚴(yán)重影響魚類的健康生存甚至威脅到人類的身體健康，因此研究嗜水氣單胞菌的毒力因子具有重要的意義。本研究通過脫脂牛奶平板和綿羊血平板檢測(cè)胞外蛋白酶活性和溶血性，發(fā)現(xiàn)野生菌和ΔAHA_2474和ΔAHA_2476突變株在其菌落外圍均能形成水解圈，即均具有胞外蛋白酶活性，但ΔAHA_2474突變株的水解圈略微大于野生菌的水解圈，ΔAHA_2476突變株的水解圈顯著大于野生菌的水解圈（圖2-A），表明AHA_2474和AHA_2476基因缺失后細(xì)菌胞外蛋白酶活性增強(qiáng)，說明AHA_2474和AHA_2476基因參與了蛋白酶的產(chǎn)生，使該菌毒性增強(qiáng)；而溶血性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明野生株和AHA_2474、AHA_2476突變株在其菌落外圍都能形成溶血圈，但ΔAHA_2474和ΔAHA_2476突變株的溶血圈明顯大于野生菌的溶血圈（圖2-B），表明AHA_2474和AHA_2476基因缺失后細(xì)菌溶血性的形成能力增強(qiáng)，說明AHA_2474和AHA_2476基因參與了溶血素的產(chǎn)生，使該菌毒性增強(qiáng)。

表1 基因敲除引物

圖1 基因缺失突變株的構(gòu)建

圖2 野生菌與ΔAHA_2474、ΔAHA_2476 敲除菌在體外胞外蛋白酶和溶血性的比較

2.3 DIP對(duì)ΔAHA_2474、ΔAHA_2476生長(zhǎng)情況的 影響

因ΔAHA_2474、ΔAHA_2476與鐵離子相關(guān)，為了探索在鐵離子限制條件下是否對(duì)缺失菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，本研究比較了野生型菌株與ΔAHA_2474、ΔAHA_2476敲除菌株在缺鐵條件下的生長(zhǎng)能力。當(dāng)加入鐵離子螯合劑DIP 后，野生株生長(zhǎng)顯著高于ΔAHA_2474、ΔAHA_2476（圖3），說明ΔAHA_2474、ΔAHA_2476可能通過影響鐵離子的動(dòng)態(tài)平衡來影響突變株的生長(zhǎng)。

圖3 DIP 條件下野生型菌株和DAHA_2474、DAHA_2476生長(zhǎng)能力的比較

2.4 CAS培養(yǎng)基測(cè)定

細(xì)菌分泌的鐵載體能鰲合CAS 染液中Fe3+而導(dǎo)致顏色由藍(lán)變橙，從而測(cè)定微生物合成嗜鐵素的能力。利用CAS 液體培養(yǎng)基觀察細(xì)菌鐵載體的產(chǎn)生，菌株在 CAS 液體培養(yǎng)基中的顏色的變化。與野生株相比，缺失菌ΔAHA_2474、ΔAHA_2476在檢測(cè)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和顏色變化慢，培養(yǎng)12h就可見試管中野生型菌株出現(xiàn)明亮醒目的橙黃色液體（圖4），而缺失菌ΔAHA_2474僅出現(xiàn)微弱的鐵載體，使得試管中僅出現(xiàn)微弱的橙黃色，但ΔAHA_2476在同一時(shí)間是顏色還處于藍(lán)色，說明缺失菌ΔAHA_2474、ΔAHA_2476影響鐵載體的產(chǎn)生。

圖4 CAS 培養(yǎng)基檢測(cè)野生株和ΔAHA_2474、ΔAHA_2476鐵載體產(chǎn)生情況

2.5 M9限制性培養(yǎng)基測(cè)定結(jié)果

M9 限制性培養(yǎng)基通過對(duì)鐵離子的限定來測(cè)定。 通過補(bǔ)充50 μg/mL 的FeCl3測(cè)定野生株與ΔAHA_2474、 ΔAHA_2476突變菌株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在缺鐵的M9 培養(yǎng)基下，缺失菌ΔAHA_2474、ΔAHA_2476的生長(zhǎng)要比野生型弱，而在M9 培養(yǎng)基中補(bǔ)充終濃度為50 μg/mL FeCl3時(shí)發(fā)現(xiàn)野生株與缺失菌ΔAHA_2474、ΔAHA_2476的生長(zhǎng)能力相當(dāng)（圖5）。

2.6 對(duì)過氧化物的耐受性測(cè)定

為了解ΔAHA_2474、ΔAHA_2476是否參與調(diào)節(jié)對(duì)氧化壓力的應(yīng)激過程，從而有助于嗜水氣單胞菌適應(yīng)外界環(huán)境的突變情況，本研究測(cè)定了ΔAHA_2474、ΔAHA_2476對(duì)過氧化物的應(yīng)激能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6），ΔAHA_2474突變株對(duì)H2O2（2.5 mmol/L）敏感；而ΔAHA_2476不敏感，與野生菌株相比，ΔAHA_2474菌株具有更大的耐受性，以上結(jié)果說明，AHA_2474基因可能參與嗜水氣單胞菌的氧化應(yīng)激生理過程。

圖5 測(cè)定鐵離子限制條件下野生株和ΔAHA_2474、ΔAHA_2476 生長(zhǎng)能力的比較

3 討論

圖6 在2.5 mmol/L H2O2 處理下，不同稀釋倍數(shù)下野生株、ΔAHA_2474 和ΔAHA_2476 菌株耐受性測(cè)定

通常，細(xì)菌必須從宿主或復(fù)雜的自然環(huán)境中捕獲有限的鐵資源，以滿足生物體對(duì)鐵的正常需求。因此，細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出多種獲取鐵的方法，包括通過特定受體和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的鐵載體介導(dǎo)鐵的獲取。鐵載體是一種低分子量小于10 kD 的高親和力鐵離子特異性螯合劑，在鐵饑餓時(shí)會(huì)被細(xì)菌分泌出胞外，以螯合劑的形式與宿主或者環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)可利用的鐵離子，從而維持細(xì)菌的正常生長(zhǎng)［13］。鐵在病原體的代謝過程中起重要作用，例如病原體中的毒力，氧化應(yīng)激耐受性等［14］。已有研究表明，鐵載體在不同的細(xì)菌中的功能具有多樣性，如有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鐵離子相關(guān)基因（tonB）缺失后，愛德華氏菌的產(chǎn)鐵能力下降，毒力、溶血能力以及形成鐵載體的能力都會(huì)產(chǎn)生顯著變化［15-17］；研究表明，大腸桿菌儲(chǔ)鐵蛋白Dps 可以通過鐵氧化酶活性的變化對(duì)過氧化氫的耐受性產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步影響細(xì)菌的存活［18-19］。嗜水氣單胞菌的致病性與溶血素、胞外蛋白酶、粘附因子等多種毒力因子的分泌密切相關(guān)［20］。有研究表明，鐵限制條件下能夠誘導(dǎo)細(xì)菌的胞外蛋白酶活性［21］。因此，當(dāng)敲除掉嗜水氣單胞菌的非核糖體肽合成酶基因AHA_2474，AHA_2476基因后，可能影響非核糖體肽整個(gè)基因簇的功能，造成該菌對(duì)非核糖體肽的合成能力減弱，從而導(dǎo)致鐵載體的量減少，使該菌處于低鐵狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)AHA_2474，AHA_2476敲除株的胞外蛋白酶活性增強(qiáng)。而非核糖體肽是細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物，可以以鐵載體的形式與鐵離子高親和性螯合，參與病原菌的毒性、抗逆性等多種重要的生理功能。Qassim 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，伯克霍爾德菌的非核糖體肽合成酶在鐵載體的合成過程中起著非常重要的作用，當(dāng)菌株在鐵受限的條件下生長(zhǎng)時(shí)，非核糖體肽合成酶的基因簇會(huì)指導(dǎo)合成鐵載體，進(jìn)而維持細(xì)菌對(duì)鐵的正常需求。本研究發(fā)現(xiàn)敲除掉嗜水氣單胞菌非核糖體肽合成酶的基因后，該菌的生理功能也有著顯著變化，如胞外蛋白酶活性及溶血性均增強(qiáng)，產(chǎn)鐵能力下降，對(duì)過氧化氫的耐受性增強(qiáng)，表明非核糖體肽在嗜水氣單胞菌的生理功能中起著非常重要的作用。綜上所述，本研究通過基因敲除的方法，獲得敲除株ΔAHA_2474、ΔAHA_2476，對(duì)其基因功能進(jìn)行研究，為探究該菌的致病機(jī)制及防治策略提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過同源重組方法成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌ATCC7966 中AHA_2474與AHA_2476的突變株。通過比較缺失株與野生株之間的胞外蛋白酶活性，溶血性存在顯著性的差異，表明這兩個(gè)基因的缺失可能使該菌毒性增強(qiáng)。又發(fā)現(xiàn)AHA_2474、AHA_2476的缺失導(dǎo)致細(xì)菌在鐵離子限制條件下，菌株的生長(zhǎng)能力顯著下降，而補(bǔ)充鐵離子后又能恢復(fù)生長(zhǎng)。一系列的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明AHA_2474、AHA_2476基因的缺失可能是導(dǎo)致嗜水氣單胞菌產(chǎn)鐵能力下降的重要原因之一。