傅 奇, 林俊杰, 甘美裕, 盧源欽, 肖玉娟

16S與基因聯合建樹快速鑒定海水中的一株地衣芽胞桿菌

傅 奇, 林俊杰, 甘美裕, 盧源欽, 肖玉娟

(廈門華廈學院 環(huán)境與公共健康學院, 福建 廈門 361024)

在保守序列高度相似的細菌鑒定中, 單獨使用16S rDNA/RNA序列進行比對和構建進化樹通常無法準確鑒定到種, 需要增加測序基因數并對多基因進行分析。為實現快速鑒定, 課題組對16S與基因聯合建樹的方法進行了研究, 將海洋來源的一株桿菌, 分別用通用引物擴增16S和基因并測序, 在GeneBank進行序列比對后, 選擇各菌種保藏中心16S和基因均相似的菌株, 取16S和基因序列, 采用Paup* 4.0構建進化樹。使用16S與拼接序列構建的進化樹中屬于同一種的菌株均很好的聚合在一枝, 種間分枝自展值均高于98, 分類結構準確, 篩選得到的桿菌與地衣芽胞桿菌()聚合在一枝, 自展值為100, 鑒定為地衣芽胞桿菌。經生理生化試驗驗證, 該菌株與地衣芽胞桿菌特征完全一致, 使用16S和基因聯合建樹得到的鑒定結果準確且快速簡便。

16S;; 進化樹; 地衣芽胞桿菌 ()

芽胞桿菌()是一個重要的微生物類群, 包括枯草芽胞桿菌()、地衣芽胞桿菌()、凝結芽胞桿菌()、炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()等與發(fā)酵工業(yè)和生活密切相關的多個菌種[1]。其中地衣芽胞桿菌由于生物安全性好、產生多種功能性代謝產物, 在藥品[2]、功能食品[3]、飼料[4]和發(fā)酵工業(yè)[5-7]得到廣泛應用, 其中海洋來源的地衣芽胞桿菌在海水污染處理、新型生物活性物質開發(fā)方面具有重要潛力[8, 9]。但在地衣芽胞桿菌的篩選過程中, 由于芽胞桿菌類群保守序列的高度相似性, 無法單獨依靠常用的16S rDNA/RNA測序來準確定位到種, 通常需要結合生理生化鑒定[10, 11]或者其他序列, 如5'端16S-23S ITS核苷酸序列[12]、基因[13]、A[14]甚至全基因序列[15, 16]進行分析。基因編碼DNA促旋酶的B亞單位, 在細菌中廣泛存在, 序列相對保守, 但進化速度快于16S, 目前在細菌鑒定中的使用逐漸增加[17], 積累了較為豐富的比對數據庫, 但單獨使用時部分芽胞桿菌也難以準確定位, 而16S與序列分別比對建樹的方法容易出現進化樹結構沖突, 干擾定位的情況。利用16S與基因聯合建樹, 以較少的序列數和進化樹數實現對篩選菌株快速鑒定的方法, 可提高數據的利用率, 減少數據沖突, 為芽胞桿菌種群的分子生物學鑒定方法開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

分離菌株樣本為海泥, 采集于廈門市集美區(qū)紅樹林區(qū)。

1.2 材料與試劑

2216E(液體)、2216E瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、V-P試劑盒、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、色氨酸肉湯、克氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、苯丙氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、明膠生化管、硝酸鹽還原試劑盒、Kovacs氏靛基質試劑盒等培養(yǎng)基與鑒定試劑均由青島海博生物科技有限公司生產; 細菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR試劑由生工生物工程(上海)股份有限公司生產; 16S通用引物27F/1492R、擴增引物UP-1/UP-2r、測序引物UP-1S/UP-2Sr[18]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器與設備

PCR儀: 新加坡ESCO公司; 核酸電泳儀: 美國GE公司; 搖床: 上海蘇坤公司; 生化培養(yǎng)箱: 上海一恒公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理方法

取海泥25 g加入225 mL 2216E液體培養(yǎng)基均質后稀釋涂布2216E瓊脂平板, 30℃培養(yǎng)48 h, 取單菌落進行純化。

1.4.2 16S與序列提取

用細菌基因組DNA抽提試劑盒, 提取菌株的總DNA; 分別用16S與擴增引物擴增, 所得PCR產物電泳純化后, 送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

16S擴增條件: 94℃預變性4 min; 94℃變性30 s, 65℃退火40 s, 72℃延伸90 s, 共35個循環(huán); 72℃延伸10 min。

擴增條件[18]: 94℃預變性4 min; 94℃變性1 min, 60℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 共35個循環(huán); 72℃延伸10 min。

1.4.3 16S與序列比對與進化分析

將測序結果在Genbank進行比對。為保障數據的準確性, 取相似度較高的1 000個序列中的各菌種保藏中心菌株進行比對, 包括ATCC、NCTC、BCRC、DSM 4個菌種保藏中心菌株。下載相似菌株的16S與序列, 分別用BioEdit[19]和Clustal X[20]進行比對和編輯, 取有效區(qū)間, 分別使用16S、和16S與線形拼接序列建樹[21], 采用最大簡約算法, 用Paup* 4.0構建進化樹[22, 23], 選擇大腸桿菌ATCC 25922[24]作為外群。

1.4.4 生理生化驗證

參考《伯杰細菌鑒定手冊》[1]和行業(yè)標準《飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》[25]進行驗證。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化

從海泥中篩選得到一株革蘭氏陽性桿菌, 產芽胞, 菌落濕潤, 呈白色, 編號為HX2019004。

2.2 16S與gyrB基因測序

測序所得16S與序列拼接后有效區(qū)域分別為1 430 bp和1 115 bp。

2.3 序列比對與進化樹構建

16S序列比對結果中, 高相似度菌株過多, 且多數菌株無法獲得更多的遺傳標記序列; 而序列比對結果中, 多數菌株同時可獲取16S序列, 因此, 以相似菌株作為建樹群, 下載16S與基因序列(表1), 比較分別使用16S、和16S與線形拼接序列建樹結果。

16S比對后去除頭尾不整齊片段, 保留中心區(qū)域1 440 bp(含gap);比對后去除頭尾不整齊片段,保留中心區(qū)域1 056 bp(含gap)。構建進化樹如圖1所示, A樹基于16S序列構建, B樹基于序列構建, C樹基于16S與拼接序列構建, 計算次數為1 000, 參數如表2所示。

表1 GenBank中擁有相似16S與gyrB序列的菌株

續(xù)表

圖1 基于16S與gyrB序列的進化樹(A基于16S序列, B基于gyrB序列, C基于16S與gyrB拼接序列)

表2 基于16S與gyrB序列的進化樹參數表

從圖1中可以看出, 僅使用16S序列構建的進化樹A分枝自展值低, 無法準確定位HX2019004菌株與、、的進化關系; 僅使用序列構建的進化樹B整體分枝自展值較高, 但一致性指數(CI)較低, 且HX2019004菌株與的分類關系存在疑義, 與A樹存在較大的結構沖突; 使用16S與拼接序列構建的進化樹C中, 同一類菌種均很好的聚合在一枝, 種間分枝自展值均高于98, 表明分類結構準確, HX2019004菌株與地衣芽胞桿菌聚合在一枝, 自展值為100, 表明該菌株為地衣芽胞桿菌可能性高。

2.4 生理生化驗證

菌株HX2019004可液化明膠、水解淀粉、還原硝酸鹽, 可利用檸檬酸鹽做為碳源, 可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產酸, 可分解酪素, 可使牛奶胨化, 可在pH 5.5~8.7范圍內、0.001%溶菌酶、7%NaCl、厭氧瓊脂中生長, V-P反應、接觸酶反應陽性; 不能使苯丙氨酸脫氨, 不能使牛奶凝固, 不能分解酪氨酸, 卵黃反應和吲哚反應呈陰性。試驗結果與地衣芽胞桿菌生理生化特征吻合[25], 與進化分析結果一致, 命名為HX2019004。

3 結論

利用16S與基因聯合建樹的方法, 課題組快速將一株從海水中篩選得到的芽胞桿菌HX2019004準確鑒定為地衣芽胞桿菌, 表明該方法在保守序列高度相似菌種間的分類鑒定中具有深入研究的價值。與常用的增加測序基因數的方法相比, 該方法測序量小, 時間短, 數據利用率高; 與多基因分別建樹的方法相比, 可避免進化樹結構之間的沖突和數據紊亂, 提高了進化樹準確性。課題組下一步將繼續(xù)研究該方法在其他菌群鑒別中的有效性。

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Identification of astrain from seawater using a phylogenetic tree based on 16S andgene sequences

FU Qi, LIN Jun-jie, GAN Mei-yu, LU Yuan-qin, XIAO Yu-juan

(College of Environment and Public Health, Xiamen Huaxia University, Xiamen 361024, China)

For identifying bacteria with highly similar conserved sequences, 16S rDNA does not provide adequate resolution for comparative sequence analysis; therefore, more DNA sequences and analysis models are required for classification. To develop a rapid identification method, phylogenetic trees based on 16S andgene sequences were investigated. A strain of bacillus was isolated from seawater, and the 16S andgenes of the strain were amplified with universal primers and sequenced. Using BLAST in GenBank, other strains with similar 16S andgenes were selected. Phylogenetic trees based on 16S andgenes were constructed using PAUP* 4.0. In the tree constructed using sequences of both 16S andgenes, strains belonging to the same species were clustered together, the self-expanding values of the branches were higher than 98, and the classification structure was accurate. The isolated strain polymerized within the phylogenetic tree, and the self-expanding value was 100. Physiological and biochemical tests verified that the strain belongs to the species. Thus, the identification of this strain ofobtained by construction of a phylogenetic tree based on the combination of 16S andgenes was accurate, rapid, and simple.

16S;; phylogenetic tree;

Oct. 18, 2019

[Fujian Education and Scientific Research Project for Young and Middle-aged Teachers, No. JAT170821; The Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program of Fujian Province, No. 201812709001; Teaching Reform Research Project of Fujian Province, No. FBJG20180124]

Q939

A

1000-3096(2020)04-0090-06

10.11759/hykx20191018002

2019-10-18;

2019-11-08

福建省中青年教師教育科研項目(科技類)(JAT170821); 福建省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201812709001); 福建省本科高校教育教學改革研究項目(FBJG20180124)

傅奇(1986-), 男, 湖南湘潭人, 講師, 碩士, 主要從事微生物資源開發(fā), 電話: 0592-6276262, E-mail: fq@hxxy.edu.cn; 肖玉娟,

, 電話: 0592-6276260, E-mail: xyj@hxxy.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)