侯麗青，冀云鵬，朱 博，侯東霞，武麗瓊，王曉華

(內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院遺傳科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏所致的一種嚴(yán)重的遺傳性氨基酸代謝障礙性疾病，呈常染色體隱性遺傳。隨著新生兒疾病篩查的開展，越來越多的PKU患兒得到了早期診斷和治療，避免了智能發(fā)育落后的發(fā)生。PKU發(fā)生率及基因突變的種類和頻率在不同地區(qū)、不同民族差異較大，表現(xiàn)出極大的遺傳異質(zhì)性。內(nèi)蒙古地處中國中西部，人口以漢族、蒙族為主，漢族人口約占78%，為探究內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因突變的規(guī)律及特點，本研究對內(nèi)蒙古地區(qū)確診的26例漢族PKU患兒及其父母進(jìn)行PAH基因突變分析，報告如下。

1材料與方法

1.1材料

收集2015年1月至2018年10月在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院經(jīng)新生兒疾病篩查及遺傳咨詢門診確診的26例PKU患兒為研究對象，男17例，女9例，年齡0～18歲。26例患兒來自內(nèi)蒙古各地，均為漢族。所有受試患兒家長均簽署知情同意書。

采集患者血液及尿液標(biāo)本進(jìn)行血二氫蝶呤還原酶測定、BH4負(fù)荷試驗(Phe濃度>600μmol/L)或Phe和BH4聯(lián)合負(fù)荷試驗(Phe濃度≤600μmol/L)，以及尿蝶呤譜分析，排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥患者。對Phe濃度>600μmol/L患兒行低苯丙氨酸飲食控制治療。

1.2標(biāo)本采集及DNA提取

采集患兒及其父母外周靜脈血2mL，滴于濾紙上呈3～5個濾紙斑，陰涼干燥避光處晾干，1～2h后裝入無菌干凈密封袋內(nèi)備用。采用快速酚氯仿抽提法提取血斑DNA，將卡片沿血滴四周剪下，用1×TE緩沖液500μL和800μL NaCl(250mmol/L)洗滌1次，加入200μL消化緩沖液(pH=8.0的100mmol/L Tris、20mmol/L EDTA、150mmol/L NaCl、2%SDS)和5μL蛋白酶K，65℃下水浴1h。不取出血片直接在消化液中加200μL飽和酚—氯仿—已戊醇(25∶24∶1)，提取基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測定

PAH基因第1～13外顯子區(qū)域及內(nèi)含子與外顯子交接區(qū)引物序列，見表1。PCR擴(kuò)增見表2，產(chǎn)物純化及序列測定由華大基因公司完成，每個突變都采用正、反向測序證實，檢測患者父母DNA序列，以確定序列變異來源。

表1 PAH基因各外顯子引物序列Table 1 Sequences of each exons’ primers of PAH gene

表2 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序Table 2 PCR system and amplification program

注：*根據(jù)合成引物的退火溫度，PCR擴(kuò)增時調(diào)整相應(yīng)的退火溫度。

1.4突變命名和驗證

已知突變的命名結(jié)合測序結(jié)果并參照http://www.biopku.org/pah提供的突變名稱命名。新突變通過查閱PAH相關(guān)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov、http://www.biopku.org/pah等)并且排除多態(tài)性位點后，才被認(rèn)定為新突變。新突變的命名參照http://www.hgvs.org/mutnomen提供的命名法來命名。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)(n)及率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 PAH基因突變在患者中的分布

在26例患者的52個PAH等位基因中共檢測到46個突變等位基因，總檢出率為88.5%。17例患者攜帶復(fù)合雜合突變基因，其中3例患者攜帶3個突變基因，14例患者攜帶2個突變基因；9例患者攜帶單雜合突變基因，見表3。

2.2內(nèi)蒙古地區(qū)PAH基因突變類型及特點

26例患者中共檢出24種PAH基因突變，包括16種錯義突變(66.7%)、5種剪接突變(20.8%)、2種無義突變(8.3%)和1種缺失突變(4.2%)。24種突變等位基因分布在PAH第2～3、6～8、10～12外顯子和第4、7、12內(nèi)含子中，突變頻率最高的是第7外顯子，占23.1%(12/52)，其次是第12外顯子，占13.5%(7/52)，第6、11外顯子分別占11.5%(6/52)，第3外顯子占7.7%(4/52)，第12內(nèi)含子占7.7%(4/52)，第4內(nèi)含子占5.8%(3/52)，這7個熱點突變區(qū)域占總突變的80.8%(42/52)。46個被檢出的等位基因中R243Q突變發(fā)生頻率最高(13.5%)，其次為Y356X(9.6%)、Y204C(5.8%)、R241C(5.8%)、R413P(5.8%)、IVS12+6T>A(5.8%)、I65S(3.8%)、IVS4-1 G>A(3.8%)、H170Q(3.8%)、L430P(3.8%)，這10種突變占總突變的61.5%(32/52)，見表4。

表3 PAH基因突變在26例患者中的分布Table 3 Distribution of PAH gene mutations in 26 Han ethnic PKU patients

表4 內(nèi)蒙古地區(qū)26例PKU患者PAH基因突變檢測結(jié)果Table 4 Detection results of PAH gene mutations of 26 Han ethnic PKU patients in Inner Mongolia

2.3內(nèi)蒙古與西北五省漢族PAH基因常見突變比較

內(nèi)蒙古地區(qū)漢族與西北五省類似，居于首位的PAH突變都為R243Q，但內(nèi)蒙古地區(qū)漢族R243Q突變檢出率明顯低于陜西地區(qū)漢族(χ2=3.845，P<0.05)。其他常見突變構(gòu)成明顯區(qū)別于西北五省，Y365X檢出率明顯高于陜西地區(qū)漢族(χ2=5.674，P<0.05)和甘肅地區(qū)漢族(χ2=4.031，P<0.05)，Y204C和IVS12+6T>A在西北五省中均未見檢出，然而在西北五省中突變頻率較高的EX6-96A>G在內(nèi)蒙古地區(qū)漢族中未檢出，見表5。

表5 內(nèi)蒙古地區(qū)漢族與西北五省PAH基因常見突變頻率比較(%)Table 5 Comparison of common mutations’ frequency of PAH gene in the Han ethnic group between Inner Mongolia and the five provinces of northwest China (%)

注：*P<0.05。

3討論

3.1內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH突變檢出率較低的原因分析

本研究對內(nèi)蒙古地區(qū)26例漢族患者PAH基因的13個外顯子區(qū)域及其與內(nèi)含子連接區(qū)域測序分析，發(fā)現(xiàn)PAH突變檢出率為88.5%，與陜西地區(qū)漢族[1](89.1%)、新疆地區(qū)漢族[5](90.1%)相比，突變檢出率較低，但高于甘肅地區(qū)漢族[2](77.6%)、寧夏地區(qū)漢族[3](75%)和青海地區(qū)漢族[4](85.9%)。分析認(rèn)為一方面原因可能與采用的方法有關(guān)，本研究僅用PCR擴(kuò)增及測序一種方法，如聯(lián)合應(yīng)用高分辯溶解曲線和多重連接依賴探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)，可顯著提高PAH突變基因的檢出率；另一方面可能是某些基因突變在本方法檢測區(qū)域之外，如與基因表達(dá)密切相關(guān)的啟動子、順式作用元件、反式作用因子和深度內(nèi)含子區(qū)域等，這可能也是部分患兒未完全檢測出突變的原因。

3.2內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因突變分布特點及突變熱點

本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PKU患兒的PAH基因突變主要分布在第7、12、6、11、3外顯子和第12、4內(nèi)含子，與中國北方漢族人群PAH突變分布基本一致[6]，與歐洲人更多集中在第3、10、12外顯子明顯不同[7]，這充分說明內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因突變既具有保守性又有高度異質(zhì)性的特征。另外，研究還發(fā)現(xiàn)R243Q在內(nèi)蒙古地區(qū)漢族檢出率最高，與陜西、山西、新疆等中國北方地區(qū)一致[8-10]，但區(qū)別于中國南方地區(qū)，江蘇地區(qū)檢出率最高的為R241C(11%)和EX6-96A>G(6%)[11]，廈門和我國臺灣地區(qū)檢出率最高的為R241C[12-13]，表明PAH基因突變在中國南方和北方地區(qū)存在顯著差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)漢族檢出率較高的突變Y204C和IVS12+6T>A，在西北五省均未檢出，R241C在甘肅、寧夏、青海地區(qū)漢族中均未檢出，在陜西和新疆地區(qū)漢族中雖有檢出但突變率也較低(1.02%和3.5%)，提示這3種突變可能是內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群特殊的PAH突變類型。本研究也提示內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因突變已形成具有鮮明地域特征的分布規(guī)律和特點，這對內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PKU患兒的診斷和產(chǎn)前診斷具有重要價值。

3.3內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因新突變

本研究還發(fā)現(xiàn)了2種PAH基因新突變c.1065G>T(Q355H)和c.1316-286A>C，經(jīng)檢索國際PAH基因突變數(shù)據(jù)庫(截至2018年12月)，確認(rèn)為中國人群中存在的國際上首次發(fā)現(xiàn)的PAH基因新突變。c.1065G>T突變位于PAH催化區(qū)，由于第1 065位核苷酸鳥嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?，?dǎo)致第355位編碼谷氨酰胺的密碼子(CAG)變成了編碼組氨酸的密碼子(CAT)，改變了PAH的結(jié)構(gòu)并影響了酶的活性功能。c.1316-286A>C是其中一個患兒中檢測到的唯一突變，該突變?nèi)绾斡绊懨傅鞍坠δ苓€需我們進(jìn)一步研究。

3.4小結(jié)

內(nèi)蒙古地區(qū)檢出的PAH基因突變特點復(fù)雜多樣，既包含我國北方地區(qū)的常見突變類型，也與西北各省區(qū)基因突變分布特征有所不同。本研究分析了內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PAH基因的突變類型、頻率及特點，為內(nèi)蒙古地區(qū)漢族PKU患者篩查提供了數(shù)據(jù)資料，同時對本地區(qū)有效降低PKU發(fā)病率，提高人口素質(zhì)具有重要意義。