張 雯, 王建軍, 房茹茹, 黨苗苗

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

酸乳具有調(diào)節(jié)人體腸道中微生物菌群平衡、促進(jìn)鈣、鎂、單糖等吸收、控制體內(nèi)毒素、改善肝功能等作用，同時(shí)以其獨(dú)特的營養(yǎng)和風(fēng)味風(fēng)靡全世界[1].但制備過程中脂肪上浮和蛋白質(zhì)沉淀問題一直制約著其產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)[2]，目前已成為酸乳制備工藝的研究熱點(diǎn)，將膳食纖維作為穩(wěn)定劑加入其中是解決方案之一，國內(nèi)外已經(jīng)做了一些研究.

細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)是由微生物合成的、由吡喃葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而成的鏈狀高分子聚合物，呈現(xiàn)獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3].作為膳食纖維，BC可改善糖代謝，對(duì)糖尿病患者血糖控制具有積極作用[4]；對(duì)高脂肪膳食引起的肝脂肪病變有阻抑作用[5]，能夠起到預(yù)防脂肪肝的作用；BC獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其具有增稠、乳化等作用，影響食品分子結(jié)構(gòu)、膠凝和粗度，可作為穩(wěn)定劑部分替代酸乳中外源添加的穩(wěn)定劑，減少食品添加劑的使用，降低成本.

將BC與酸乳結(jié)合制備新型膳食纖維酸乳，有望改善酸乳脂肪上浮和蛋白質(zhì)沉淀的問題，同時(shí)使酸乳產(chǎn)品進(jìn)一步功能化.該類產(chǎn)品的開發(fā)可豐富酸乳市場(chǎng)產(chǎn)品類型，促進(jìn)BC在食品行業(yè)的應(yīng)用.文獻(xiàn)[6-16]從不同方面報(bào)道了果膠作為復(fù)配劑或單獨(dú)使用對(duì)乳體系相分離及穩(wěn)定性的影響研究，為不同食品添加劑在酸奶中的應(yīng)用提供一定的理論支持和技術(shù)參考.田芬等[17]表明水溶性膳食纖維能夠增大體系的粘度和粒度.Jagannath等[18]表明BC或Nata可以為乳酸菌發(fā)酵過程提供支持.

本文以新鮮生牛乳為原料，添加BC制備新型膳食纖維酸乳，旨在改善酸乳產(chǎn)品蛋白質(zhì)沉淀的問題.研究了BC酸乳發(fā)酵過程中發(fā)酵乳含量、BC添加量、復(fù)配穩(wěn)定劑種類及含量等因素對(duì)BC酸乳的影響及環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響.本研究所制備BC酸乳具有更好的營養(yǎng)和保健功能，且能夠減少酸乳飲料生產(chǎn)過程中穩(wěn)定劑的使用.該研究為功能性食品的進(jìn)一步開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

生牛乳，陜西科技大學(xué)沁園餐廳提供；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，ST)、 保加利亞桿菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)、木糖葡糖酸醋桿菌(Acetobacterxylinum) ，陜科大實(shí)驗(yàn)室分離保藏 ；其余試劑均為市售分析純或生化試劑.

種子培養(yǎng)基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氫二鈉4～5 g/L，檸檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氫二鈉4～5 g/L，檸檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

1.1.2 主要儀器

MJ-250恒溫培養(yǎng)箱，上海百典儀器設(shè)備有限公司；YP402N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE52CS-1型zeta電位儀，上海亞榮生化儀器廠；S-4800型掃描電鏡，日立高新科技國際貿(mào)易有限公司；TDL-40B型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BC制備

將木糖葡糖酸醋桿菌(Acetobacterxylinum)活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，得種子液，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下發(fā)酵10 d，將發(fā)酵液液面上層的BC膜取出水洗，80 ℃下，1.0%～1.5% NaOH溶液中浸泡30 min，水洗至BC膜呈透明狀，在110 ℃下干燥，得到BC，再將BC勻漿(15 000 r/min，4 min)可得絮狀BC.

1.2.2 酸乳制備

移取15 mL新鮮生牛乳于厭氧管中， 95 ℃滅菌20 min，冷卻后分別按5%接種量接種LB和ST，45 ℃培養(yǎng)3 h，得發(fā)酵劑.取150 mL脫脂鮮牛乳置于250 mL藍(lán)口瓶中，加入2%蔗糖，封裝殺菌，按總接種量10%接入發(fā)酵劑(LB∶ST=1∶1)，45 ℃發(fā)酵4 h得發(fā)酵乳.發(fā)酵乳經(jīng)攪拌(15 000 r/min,10次,15 min)得中間乳，將絮狀BC加入中間乳中，經(jīng)均質(zhì)(400 Pa,10次)、后熟(4 ℃，12 h)得BC酸乳成品.

1.2.3 BC酸乳制備工藝優(yōu)化

選10名有經(jīng)驗(yàn)的品嘗人員對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行品嘗，采用100分制評(píng)分法，從組織狀態(tài)、沉淀析出情況、口感、風(fēng)味四個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)(表1)[19]，以BC酸乳分層時(shí)間和感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)發(fā)酵乳含量(30%、35%、40%、45%、50%)、BC添加量(2.5%、3%、3.5%、4%、6%)、CMC/黃原膠(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 )進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素對(duì)BC酸乳制備的影響及其適宜水平.

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)BC酸乳制備影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn),以感官評(píng)分及分層時(shí)間為考核指標(biāo)，確定BC酸乳制備最優(yōu)工藝.采用酸堿滴定法測(cè)定所制備BC酸乳酸度；采用PHS-2 酸度計(jì)測(cè)定pH；采用平板法測(cè)定活菌數(shù).

表1 BC酸乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 BC酸乳形貌表征

將BC酸乳儲(chǔ)存于冷藏柜中，觀察其凝乳狀態(tài)；對(duì)BC及BC酸乳冷凍干燥后噴金處理，利用 SEM 觀察其微觀形貌.

1.2.5 BC酸乳的穩(wěn)定性能

(1)環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性的影響

制備BC酸乳，將其稀釋至不同質(zhì)量濃度(5%、10%、15%)，分別測(cè)定其在不同pH(3、4、5、6、7、8)，NaCl溶液(50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L)和溫度(0、30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃)下的沉淀率，研究環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性的影響.沉淀率采用以下方法進(jìn)行測(cè)定：取10 mL BC酸乳，質(zhì)量記為W1，3 000 r/min離心10 min，傾去上層清夜，將沉淀物在100 ℃下烘干60 min，質(zhì)量記為W2可采用公式(1)計(jì)算BC酸乳沉淀率：

(1)

(2)環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳δ電位的影響

分別取50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L NaCl溶液，稀釋BC酸乳至1%，室溫下存儲(chǔ)24 h， 3 000 r/min離心10 min，利用zeta電位測(cè)定儀測(cè)定樣品表面電荷分布情況.每份樣品測(cè)定三次，取其平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 BC酸乳制備工藝優(yōu)化

2.1.1 BC酸乳制備工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

(1)發(fā)酵乳含量對(duì)BC酸乳的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵乳含量增大，分層時(shí)間及感官評(píng)價(jià)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì).當(dāng)發(fā)酵乳含量為30%時(shí)，發(fā)酵乳會(huì)出現(xiàn)明顯的發(fā)酵香味不足，口感稀薄等問題；當(dāng)發(fā)酵乳含量達(dá)40%時(shí)，儲(chǔ)存12天之后出現(xiàn)分層，且感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)最高，當(dāng)發(fā)酵乳含量達(dá)到更高時(shí)，分層時(shí)間和感官評(píng)級(jí)分?jǐn)?shù)均下降，由此可見發(fā)酵乳含量過高會(huì)使得BC與酪蛋白過度結(jié)合從而影響互傳三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致酸乳穩(wěn)定性降低，且發(fā)酵乳過多會(huì)導(dǎo)致一定程度上的乳清分離進(jìn)而影響酸乳口感.

圖1 發(fā)酵乳含量對(duì)BC酸乳的影響

(2)BC添加量對(duì)BC酸乳的影響

由圖2可知，2.5%～4%的添加量對(duì)酸乳的色澤，凝結(jié)狀態(tài)，口感都有較好的影響.隨著BC添加量的增大，當(dāng)BC添加量為6%時(shí)，樣品分層時(shí)間與感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)有所降低，這是由于BC親水基團(tuán)與酪蛋白結(jié)合，對(duì)水分的束縛能力加強(qiáng)，因而乳清的析出速率慢.此外，BC添加量為4%的樣品無沉淀析出，酸度適中，口感清爽有酸奶香味，故選取4%作為酸乳的BC添加量.

圖2 BC添加量對(duì)BC酸乳的影響

(3)復(fù)配穩(wěn)定劑比例對(duì)BC酸乳的影響

由圖3可知，以CMC為主體穩(wěn)定劑，分別配以明膠、黃原膠和海藻酸鈉，當(dāng)CMC與黃原膠復(fù)配使用時(shí)，酸乳穩(wěn)定性相對(duì)較好，且當(dāng)其比例為1∶2時(shí)，穩(wěn)定性效果最佳，CMC與海藻酸鈉復(fù)配效果次之，與明膠復(fù)配效果最差.

圖3 復(fù)配穩(wěn)定劑比例對(duì)BC酸乳的影響

2.1.2 BC酸乳制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示.由表3可知，三因素對(duì)BC酸乳的影響主次順序?yàn)椋築C添加量>發(fā)酵乳含量>復(fù)配穩(wěn)定劑(CMC/黃原膠總量為0.5%)比例.各因素的最優(yōu)水平是A1B1C1，即BC的添加量為3%、發(fā)酵乳含量為35%、復(fù)配穩(wěn)定劑CMC/黃原膠=1∶1，復(fù)配穩(wěn)定劑總量為0.5%，如表4所示.在此條件下制備的BC酸乳在4 ℃下貯存33天后開始分層，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為95分，酸度為79 °T，pH為4.62，活菌數(shù)為1.79×108cfu/mL.

表2 正交試驗(yàn)因素水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 BC酸乳理化性質(zhì)

2.2 BC酸乳形貌

2.2.1 BC酸乳表觀形貌

圖4所示為不同BC添加量酸乳外觀形貌.BC酸乳中，BC纖維束通過非共價(jià)相互作用附著于酪蛋白上，均勻地分散在蛋白質(zhì)中，可能是由于在低溫條件下形成大量氫鍵，這使得BC與蛋白質(zhì)通過良好的網(wǎng)絡(luò)互穿作用相互結(jié)合，因此所形成的乳液最穩(wěn)定.

由圖4可知，BC酸乳呈現(xiàn)乳白色，未見明顯分層，氣味清香 ，其中，加入4%的BC酸乳外觀穩(wěn)定性最好.未加BC時(shí)，酸乳分層時(shí)間較快且口感略差；加入2% BC時(shí)，其添加量太少，不足以形成強(qiáng)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來更好的穩(wěn)定酸乳；加入6%的BC時(shí)，BC分布不均勻，連續(xù)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)被破壞，蛋白質(zhì)和BC發(fā)生聚集，影響酸乳的穩(wěn)定性而導(dǎo)致分層.

圖4 不同BC添加量的酸乳

2.2.2 BC酸乳微觀形貌

對(duì)BC微觀形貌進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示.其中，圖5(a)、(b)為BC的表面形貌SEM， (c)、(d)為斷層形貌SEM.由圖5可知，BC具有典型的三維網(wǎng)狀層狀結(jié)構(gòu)，各纖維絲相互纏繞形成致密的網(wǎng)絡(luò),正是由于其復(fù)雜的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可與酪蛋白結(jié)合，從而起到穩(wěn)定乳液的作用.

圖6所示為BC酸乳中固形物的微觀形貌.新鮮生牛乳中酪蛋白占牛乳蛋白總量的80%～82%，因此，為解決乳蛋白在酸性條件下的變性沉淀，需研究穩(wěn)定劑與乳蛋白之間的相互作用.將BC作為穩(wěn)定劑加入，其中一部分BC與蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生靜電相互作用同時(shí)吸附在蛋白質(zhì)顆粒的表面，以此來提供空間位阻效應(yīng)來維持酪蛋白在酸性條件下的穩(wěn)定性；另一部分BC以增加體系粘度的方式減緩酪蛋白的沉降速率.

總體而言，其致密的微觀結(jié)構(gòu)說明了BC氫鍵含量較多且可通過氫鍵作用與蛋白質(zhì)良好兼容.此外，BC纖維絲束同樣與蛋白質(zhì)聚集體連接在一起，在酸乳中加入BC也影響了蛋白質(zhì)的聚集，BC之間形成了三維結(jié)構(gòu)，這種三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以將蛋白質(zhì)分開來阻止蛋白質(zhì)的聚集也能夠使蛋白原嵌入其中，這種互穿三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更不易聚集形成沉淀.

(a)表面放大5K (b)表面放大50K

(c)斷層放大2K (d)斷層放大10K圖5 BC表面及斷面形貌SEM圖

(a)非BC酸乳微觀放大20 K (b)BC酸乳橫面微觀放大20 K

(c)BC酸乳截面微觀放大20 K (d)BC酸乳微觀放大50 K圖6 BC酸乳的微觀形貌

2.3 BC酸乳穩(wěn)定性能

2.3.1 環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(1)pH對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

酪蛋白膠粒之間有三種作用力，即范德華相互吸引作用、靜電排斥作用和空間位阻作用.κ-酪蛋白的“發(fā)層”或稱之為“聚電解質(zhì)刷”提供了空間位阻作用，即當(dāng)膠粒相互碰撞時(shí)，在作用區(qū)域伸展于膠束表面的κ-酪蛋白分子將損失構(gòu)型熵并提供排斥力，防止酪蛋白粒發(fā)生聚集.這種作用表明了酪蛋白表面的κ-酪蛋白向外延伸的高度(電解質(zhì)刷高度H)與溶液pH之間的關(guān)系.

由圖7可知，當(dāng)BC的濃度較高時(shí)，其與酪蛋白的結(jié)合更加活躍而使其乳液更穩(wěn)定.隨著pH值的增大，其沉淀率逐漸減小，由于酪蛋白本身的等電點(diǎn)PI為4.6，到達(dá)酪蛋白等電點(diǎn)使會(huì)快速沉淀酪蛋白.當(dāng)pH值從3增大到5時(shí)，其沉淀率減小的較快，當(dāng)pH從5增大到6時(shí)，其沉淀率變化較小，說明此時(shí)的BC酸乳最穩(wěn)定，過酸則會(huì)影響B(tài)C酸乳的穩(wěn)定性.

圖7 pH對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(2)離子強(qiáng)度對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

BC是一種水不溶性且電負(fù)性極弱的陰離子多糖，BC酸乳的穩(wěn)定性同時(shí)受到BC添加量及環(huán)境離子強(qiáng)度的共同影響.

由圖8可知，當(dāng)BC濃度較低時(shí)，酸乳中的酪蛋白與BC間的非共價(jià)相互作用遠(yuǎn)大于靜電排斥作用，起主導(dǎo)作用的為非共價(jià)相互作用，因此BC與酪蛋白靜電排斥作用較弱，不足以充分結(jié)合酪蛋白并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定，當(dāng)BC濃度較高時(shí)，BC的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使酪蛋白顆粒大量結(jié)合于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，使得BC酸乳沉淀率下降，穩(wěn)定性提高.即在相同離子強(qiáng)度下，BC酸乳穩(wěn)定性隨著BC加量的增大而提高.

另一方面，當(dāng)BC濃度較低時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的增大，BC酸乳沉淀率逐漸增大，穩(wěn)定性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；當(dāng)BC濃度較高時(shí)，沉淀率隨離子強(qiáng)度的增大變化較小，表明BC可以減小離子強(qiáng)度對(duì)酸乳的影響.

圖8 離子強(qiáng)度對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

(3)溫度對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

BC纖維束與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間通過非共價(jià)相互作用形成互穿三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).由于氫鍵可能在低溫條件下更容易形成，而氫鍵的形成同樣利于體系內(nèi)部與酪蛋白的結(jié)合.

由圖9可知，BC酸乳穩(wěn)定性隨環(huán)境溫度的變化呈小幅度降低的趨勢(shì).因此當(dāng)溫度從30 ℃增加到50 ℃時(shí)，其沉淀率稍有增加，當(dāng)溫度從50 ℃增加到90 ℃時(shí)，其沉淀率變化不大，表明BC的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受較高溫度影響較小，因此溫度變化對(duì)酸乳的穩(wěn)定性影響不大.

圖9 溫度對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響

2.3.2 環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳δ電位的影響

(1)pH對(duì)BC酸乳δ電位的影響

在BC酸乳體系中，一部分BC吸附于酪蛋白顆粒上形成復(fù)合物結(jié)構(gòu)使得空間穩(wěn)定，另一部分會(huì)在復(fù)合物表面形成一層凝膠網(wǎng)絡(luò)來增強(qiáng)一部分穩(wěn)定性.

由于在穩(wěn)定乳液中存在靜電相互作用，在接近中性的條件下，靜電相互作用主要來源于酪蛋白中電離的酸根基團(tuán).當(dāng)兩個(gè)具有擴(kuò)散雙電層的酪蛋白膠束非常接近時(shí)，兩個(gè)雙電層的擴(kuò)散部分就會(huì)開始重疊，重疊的結(jié)果會(huì)導(dǎo)致排斥，這種排斥作用的自由能由能夠直接測(cè)量的δ電位所取代.

由圖10可知，BC酸乳的δ-電位均為負(fù)值，當(dāng)pH值從3增加到7乳液液滴的δ電位絕對(duì)值隨著pH值的增加而增加，表明可通過調(diào)節(jié)體系pH從而改變電荷大小，當(dāng)有較大靜電斥力存在于液滴之中時(shí)，BC酸乳具有更好的穩(wěn)定性.

圖10 pH對(duì)BC酸乳δ電位的影響

(2)離子強(qiáng)度對(duì)BC酸乳δ電位的影響

BC酸乳顆粒具有相當(dāng)均勻的表面，液滴的表面有性質(zhì)類似于粒子本身的顆粒存在，BC可以通過皮克林機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)機(jī)制有效的穩(wěn)定酸乳體系，皮克林機(jī)制是BC可以附著在油滴表面阻止油滴聚集，網(wǎng)絡(luò)機(jī)制指酪蛋白與BC之間形成強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由此形成的密集網(wǎng)絡(luò)可以將水和脂肪都束縛在里面而不能或者只能稍微移動(dòng)，因而阻止了相的分離，從而提高了乳液的穩(wěn)定性.

由圖11可知，BC酸乳乳液液滴的δ電位絕對(duì)值隨著NaCl濃度的增加而降低，當(dāng)NaCl濃度從0 mol/L增加到250 mol/L時(shí)，乳液液滴δ電位絕對(duì)值從26.2mv減小到12.5mv，即靜電斥力變小，體系穩(wěn)定性降低.因此較高離子強(qiáng)度環(huán)境不利于BC酸乳的穩(wěn)定.

圖11 離子強(qiáng)度對(duì)BC酸乳δ電位的影響

3 結(jié)論

BC酸乳制備的最優(yōu)工藝為：發(fā)酵乳含量為35%、BC的添加量為3%、復(fù)配穩(wěn)定劑CMC/黃原膠=1∶1、復(fù)配穩(wěn)定劑總量為0.5%，所制得的BC酸乳具有較好的穩(wěn)定性.酸乳中的酪蛋白可與BC網(wǎng)絡(luò)之間以非共價(jià)相互作用形成互穿三維結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定酪蛋白，改善酸乳脂肪上浮和蛋白質(zhì)沉淀等問題，同時(shí)BC的加入可減小環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳穩(wěn)定性能的影響.

研究結(jié)果表明，BC可以作為穩(wěn)定劑用于膳食纖維酸乳制備，減小環(huán)境應(yīng)力對(duì)BC酸乳的影響，且對(duì)于酸乳品質(zhì)有良好的改善作用.與現(xiàn)有研究對(duì)比[20-24]，單一穩(wěn)定劑的使用或其他復(fù)配穩(wěn)定劑的使用可以在一定程度上提高酸乳穩(wěn)定性，但是成本較高且依然存在穩(wěn)定能力不足、口感不佳等問題.而本研究將BC與復(fù)配穩(wěn)定劑聯(lián)合使用，在一定程度上降低了成本，為BC作為穩(wěn)定劑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了思路.這充分表明BC在酸乳工業(yè)具有良好的應(yīng)用前景.