劉玉杰， 高 巖， 劉洪達(dá)

(河北省唐山市第二醫(yī)院 足踝外科， 河北 唐山 063000 )

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關(guān)節(jié)病，主要特征為關(guān)節(jié)軟骨逐漸喪失，軟骨基質(zhì)破壞，軟骨下骨硬化，導(dǎo)致骨贅形成[1].OA的發(fā)生是由多種因素共同作用的結(jié)果，包括衰老、超負(fù)荷應(yīng)急、氧化應(yīng)激等，從而改變了關(guān)節(jié)生理和生物力學(xué)環(huán)境的變化.研究證實(shí)，某些蛋白酶和凋亡因子可誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞凋亡，是OA發(fā)生的重要因素[2,3].年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是OA發(fā)生發(fā)展的主要原因[4,5]，H2O2是由超氧岐化酶形成的超氧化合物，可以產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，從而導(dǎo)致細(xì)胞和動(dòng)物線粒體的凋亡.主要原理為H2O2改變線粒體膜，使細(xì)胞小體C進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中[6]，參與caspase-3活化，是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)節(jié)因素，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡.

自噬是細(xì)胞凋亡的另一種自毀過程，是細(xì)胞存活的重要途徑[7].越來越多的研究證實(shí)，細(xì)胞的自噬保護(hù)功能一部分是通過負(fù)調(diào)控凋亡發(fā)揮的作用.花青素是黃酮類化合物的一個(gè)重要亞科，在花、果、種子和植物葉片中含量豐富.研究證實(shí)，花青素具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗誘變的特性[8].本研究使用大鼠軟骨細(xì)胞凋亡模型，探討花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的影響.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

新生1周齡的SPF級(jí)SD大鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；花青素、CCK8、DMSO均購自美國sigma-aldrich公司，所有抗體GADPH、Bax、Bcl-2、Beclin-1、p62均購自美國cell signaling technology(CST)公司；RNA提取試劑為Trizol和real-time PCR試劑盒，購自美國Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自日本Takara公司； DMEM、胰酶、雙抗、小牛血清、PBS，均購自美國Gibco公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；酶標(biāo)儀，購自美國Thermo Fisher公司.

1.2 大鼠軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

無菌條件下取5只SD大鼠的軟骨，切碎后用0.25%的胰酶消化后，離心，預(yù)冷的PBS洗滌三次.加入0.2%的膠原酶Ⅱ 37 ℃消化4～5 h.離心后加入10%小牛血清、1%雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基吹打混勻，用200μm目篩網(wǎng)收集細(xì)胞.放入75 cm2培養(yǎng)瓶中，5% CO237 ℃孵育，作為F1代進(jìn)行培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn).

1.3 不同濃度H2O2對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活性檢測(cè)

將F1代大鼠軟骨細(xì)胞配置成1×105/mL單細(xì)胞懸液接種到96孔板內(nèi)，每孔100μL細(xì)胞待細(xì)胞貼壁后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，每6個(gè)孔為一組，分別加入濃度為0、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L的H2O2處理6 h.隨后每孔細(xì)胞加入10μL的CCK8試劑37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的吸光度.

1.4 花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞活力影響的檢測(cè)

將F1代大鼠軟骨細(xì)胞配置成1×105/mL單細(xì)胞懸液接種到96孔板內(nèi)，每孔100μL細(xì)胞待細(xì)胞貼壁后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，每6個(gè)孔為一組，分別加入0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL培養(yǎng)24 h后，在后六組均加入400μmol/L的H2O2培養(yǎng)6 h，每孔加入10μL的CCK8試劑37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的吸光度.

1.5 花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡影響的檢測(cè)

將F1代大鼠軟骨細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理)，H2O2組(400μmol/L H2O2處理大鼠軟骨細(xì)胞6h)、花青素+H2O2組(終濃度300μg/mL的花青素處理大鼠軟骨細(xì)胞24 h后，用400μmol/L H2O2處理6 h)，胰酶消化后，離心棄上清，PBS洗滌，以每1×105個(gè)細(xì)胞加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min，加入5μL的PI染色.

1.6 花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62 mRNA表達(dá)的real-time PCR檢測(cè)

按照1.5中三組細(xì)胞處理后，預(yù)冷PBS洗滌3次，1 mL的Trizol消化裂解進(jìn)行總RNA的提取，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RNA，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè).引物序列如表1所示.

表1 引物序列

1.7 花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè)

按照1.5中三組細(xì)胞處理后，預(yù)冷PBS洗滌3次，RIPA裂解并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，總蛋白與5 x SDS-PAGE loading buffer混合，100 ℃變性10 min.每孔上樣30μg變性蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(Bax、Bcl-2、Beclin-1、p62均1∶1 000稀釋和GADPH 1∶5 000稀釋)進(jìn)行封閉，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，溫室孵育1 h，以上抗體均為鼠源性抗體，TBST洗滌3次.使用BIO-RAD凝膠成像儀檢測(cè)，利用光密度軟件Quantity One分析，以目的蛋白與內(nèi)參GADPH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，各組CCK8吸光度和凋亡比例，Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62 mRNA和蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和Tukey的多重比較方法，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度H2O2對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活性的影響

如圖1所示，給予H2O2處理大鼠軟骨細(xì)胞6 h后，CCK8的檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞生存率明顯低于空白對(duì)照組.給予200μmol/L的H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞的生存能力與空白對(duì)照組沒有差異，但400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L四組生存率均明顯降低，與空白對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，但400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L四組之間沒有明顯差異，所以本文選用400μmol/L的H2O2劑量作為模型進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn).

圖1 不同濃度H2O2處理細(xì)胞的比較(*：與空白組比較，P<0.05)

2.2 不同濃度的花青素對(duì)H2O2處理細(xì)胞的影響

花青素是一種分布廣泛的多酚類[9]，是天然色素，屬于生物類黃酮，是強(qiáng)效的抗氧化劑，可以清除ROS.研究表明，花青素特別是3-糖苷在細(xì)胞中具有較強(qiáng)的氧自由基吸收能力.各種報(bào)道證實(shí)花青素可以在多種細(xì)胞系中起到抗氧化壓力的保護(hù)效果[10-12].劉國安等[13]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，花青素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化損傷致死具有抑制作用，加入200μg/mL花青素可顯著提高經(jīng)H2O2處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率.本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)(如圖2所示)，大鼠的軟骨細(xì)胞采用不同濃度的花青素(0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)處理24 h，后6組加入400μmol/L的H2O2處理6 h，可以看到300μg/mL、400μg/mL組細(xì)胞損傷要明顯輕于400μmol/L的H2O2處理組，所以，本文選用花青素300μg/mL作為花青素+400μmol/L的H2O2進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

圖2 不同濃度的花青素對(duì)H2O2處理細(xì)胞的比較(*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05)

2.3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中凋亡的比較

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞程序性死亡，它對(duì)維持細(xì)胞的平衡發(fā)揮著重要作用，凋亡過程同時(shí)受到抗凋亡和促凋亡效應(yīng)分子的調(diào)節(jié).本研究結(jié)果顯示(如圖3所示)，與空白對(duì)照組相對(duì)較，H2O2組和花青素+H2O2組的凋亡比例要明顯升高，但H2O2組與花青素+ H2O2組兩組比較，花青素+ H2O2組的細(xì)胞凋亡比例明顯較H2O2比例下降，P<0.05.提示花青素抑制H2O2處理后的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡.

C：空白對(duì)照組；H：H2O2組；AN+H：花青素+H2O2組圖3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例的比較(*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05)

2.4 各組大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62的mRNA表達(dá)的比較

如圖4所示，在mRNA水平上，與空白組比較，H2O2組的Bax和p62的表達(dá)升高，Beclin-1和Bcl-2的表達(dá)下降；與H2O2組比較，花青素+ H2O2組中Bax和p62表達(dá)下降，Beclin-1和Bcl-2表達(dá)升高，P<0.05.

(a)三組實(shí)驗(yàn)中，Bax的mRNA表達(dá)量比較

(b)三組實(shí)驗(yàn)中，Bcl-2的mRNA表達(dá)量比較

(c)三組實(shí)驗(yàn)中，Beclin-1的mRNA表達(dá)量比較

(d)三組實(shí)驗(yàn)中，p62的mRNA表達(dá)量比較圖4 各組大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62的mRNA表達(dá)(C：空白對(duì)照組；H：H2O2組；AN+H：花青素+H2O2組;*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05)

2.5 各組大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)的比較

如圖5所示，在蛋白水平上，與空白組比較，H2O2組的Bax和p62的表達(dá)升高，Beclin-1和Bcl-2的表達(dá)下降；與H2O2組比較，花青素+H2O2組中Bax和p62表達(dá)下降，Beclin-1和Bcl-2表達(dá)升高，P<0.05.

(a)三組實(shí)驗(yàn)中，各蛋白表達(dá)情況

(b)三組實(shí)驗(yàn)中，Bax相對(duì)蛋白表達(dá)量比較

(c)三組實(shí)驗(yàn)中，Bcl-2相對(duì)蛋白表達(dá)量比較

(d)三組實(shí)驗(yàn)中，Beclin-1相對(duì)蛋白表達(dá)量比較

(e)三組實(shí)驗(yàn)中，p62相對(duì)蛋白表達(dá)量比較圖5 各組大鼠軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表達(dá)(C：空白對(duì)照組；H：H2O2組；AN+H：花青素+H2O2組;*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05 )

Bax和Bcl-2的協(xié)同平衡表達(dá)是維持線粒體完整和抑制線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因素[14].Bcl-2的降低和Bax的增加可導(dǎo)致MMP的喪失，從而活化caspase-3.在本研究中，給予花青素的前處理可以改變由H2O2導(dǎo)致的Bax表達(dá)的升高和Bcl-2表達(dá)的下降，從而減少了細(xì)胞的凋亡，可以推測(cè)花青素通過抑制線粒體相關(guān)的固有途徑從而起到了抗凋亡的效果.在之后的研究中，還會(huì)針對(duì)花青素對(duì)于MMP和caspase-3進(jìn)行研究，驗(yàn)證推測(cè)的正確性.

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)平衡的重要機(jī)制，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝，能量的補(bǔ)給和移除損傷的細(xì)胞器.研究顯示在退化的軟骨細(xì)胞內(nèi)功能紊亂的細(xì)胞器大量增加，從而影響細(xì)胞的正常功能.同時(shí)自噬可以降解這些損傷分子，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，阻斷關(guān)節(jié)軟骨的退化和OA的進(jìn)展[15-17].另外，很多研究證實(shí)，在關(guān)節(jié)軟骨惡化的過程中，ROS與自噬相互作用[18,19].OA軟骨細(xì)胞相較于正常的軟骨細(xì)胞，其自噬水平降低，ROS水平增高[18]，在OA軟骨細(xì)胞中，氧化壓力抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)凋亡[20].Beclin-1和p62是自噬溶酶體形成的關(guān)鍵蛋白[21]，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Beclin-1的表達(dá)上升，p62的表達(dá)下降.本研究也證實(shí)：當(dāng)H2O2作用大鼠軟骨細(xì)胞時(shí)，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)下降，而p62表達(dá)升高，自噬作用被抑制.當(dāng)給予花青素后，可逆轉(zhuǎn)H2O2對(duì)自噬的作用.

3 結(jié)論

綜上所述，花青素通過活化自噬信號(hào)通路，降低促凋亡調(diào)控因子Bax和p62的表達(dá)，升高抗凋亡調(diào)控因子Beclin-1和Bcl-2表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)H2O2對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞的損傷，抑制其凋亡，減輕了由H2O2引起的氧化損傷作用.