鄭慧紋，閆 茹，徐琳琳，董 娜，陳 萍*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

東北酸菜是以白菜為發(fā)酵原料腌制而成，作為中國傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜食品，是餐桌上的常見美食。它的滋味咸酸鮮美、口感脆嫩誘人，有去膩開胃、醒酒提神的功效。不僅能夠提高食欲、有助消化，還可以幫助人體對(duì)鐵元素的吸收[1]。東北酸菜加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[2]，然而現(xiàn)有的蔬菜加工企業(yè)普遍采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵[3]或依賴于單一的乳酸菌發(fā)酵蔬菜，導(dǎo)致酸菜產(chǎn)品口感較差、風(fēng)味不足。國內(nèi)外的學(xué)者對(duì)酸菜中的優(yōu)勢(shì)菌群的研究往往也僅聚焦于乳酸菌和它在酸菜發(fā)酵過程中的影響[4-6]。然而研究表明，酵母菌對(duì)酸菜發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和發(fā)酵完成后成品的貯藏有著十分關(guān)鍵的作用[7-8]。在酸菜發(fā)酵過程中適時(shí)適量的添加酵母菌不僅可通過酵母本身的酒精發(fā)酵產(chǎn)出乙醇[9]，又可以通過進(jìn)一步與有機(jī)酸相互反應(yīng)產(chǎn)生酯類的芳香物質(zhì)[10-11]，豐富酸菜的口感，提高產(chǎn)品品質(zhì)。同時(shí)，酵母菌對(duì)蔬菜原料中的可發(fā)酵糖利用十分完全，能夠防止剩余可發(fā)酵糖被腐敗菌利用而致使產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，有利于延長(zhǎng)產(chǎn)品的貯藏期[12]。在東北酸菜發(fā)酵過程中添加酵母菌輔助發(fā)酵過程提高酸菜品質(zhì)具有巨大的開發(fā)前景和應(yīng)用意義。直投式發(fā)酵劑是標(biāo)準(zhǔn)化和濃縮的發(fā)酵劑菌種，可徑直放入蔬菜原料中進(jìn)行發(fā)酵，明顯縮短發(fā)酵周期，大大加強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)與安全性，使生產(chǎn)過程更為可控[13-14]。開展東北酸菜發(fā)酵酵母菌直投式發(fā)酵劑的研究，對(duì)東北酸菜生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用有重大價(jià)值。

濕物料被降溫至其的共晶點(diǎn)或者玻璃化轉(zhuǎn)變溫度之下，其中大多數(shù)水冷凍凝結(jié)為冰，剩余的水分與物料因素變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的過程稱為真空冷凍干燥[15]。細(xì)胞在這個(gè)過程中會(huì)受到多種傷害，如機(jī)械損傷、細(xì)胞膜通透性改變、蛋白質(zhì)變性、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）損傷等[16]。凍干保護(hù)劑的添加能夠提高細(xì)胞穩(wěn)定性、減少細(xì)胞在凍干過程中的受損程度[17]，使酵母菌在冷凍干燥進(jìn)程中保持原有理化特性和生物活性[18]。凍干保護(hù)劑還可充當(dāng)支持物與受體為干物質(zhì)在細(xì)胞復(fù)水的進(jìn)程中供給框架結(jié)構(gòu)[19]。目前，普遍使用、效果良好的真空冷凍干燥保護(hù)劑有海藻糖、白蛋白、明膠、山梨醇、蔗糖、乳糖、精氨酸、脫脂乳、賴氨酸、甘油、碘化鉀和聚乙二醇等聚合物等[20-21]，這些保護(hù)劑玻璃化轉(zhuǎn)化溫度高，它們利用降低游離水含量來減緩晶核生成過程，下降相變溫度，增強(qiáng)細(xì)胞膜流動(dòng)性，從而避免凍干導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，縮小菌體細(xì)胞在凍干過程中被暴露在氧氣與介質(zhì)中的面積，在菌體表面生成保護(hù)膜，提高菌體的存活率[22]。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期從發(fā)酵酸菜中分離得到并驗(yàn)證對(duì)風(fēng)味有增香作用的異常漢遜酵母（Hansenula anomala）作為東北酸菜的發(fā)酵輔助菌種，結(jié)合使用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與最陡爬坡法，篩選出具有顯著作用的保護(hù)劑成分，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化保護(hù)劑配方，最大限度提高菌體存活率，以期為東北酸菜發(fā)酵酵母菌直投式發(fā)酵劑的研究與應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異常漢遜酵母（Hansenula anomala）：本實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定并保藏；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：北京索萊寶生物科技有限公司；脫脂乳粉：完達(dá)山乳業(yè)有限公司；海藻糖、抗壞血酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸錳、谷氨酸鈉、木寡糖、甘油等（分析純）：購于天津市福晨化學(xué)試劑廠和阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2G無菌操作臺(tái)：上海鼎科科學(xué)儀器有限公司；OHG-914385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；XM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、HZQ-Q型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Neofuge 23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

異常漢遜酵母菌種活化→菌種擴(kuò)大培養(yǎng)→離心收集菌體→加入凍干保護(hù)劑→分裝→預(yù)凍→真空冷凍干燥→酵母菌凍干粉

菌種活化及培養(yǎng)：將異常漢遜酵母置于YPD培養(yǎng)基中活化，30 ℃條件下180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

離心收集菌體、分裝：用振蕩器把離心（5 000 r/min、10 min）后收集到的異常漢遜酵母菌泥與1/10原發(fā)酵液體積的凍干保護(hù)劑溶液混合振蕩，使其均勻，制為菌懸液。

預(yù)凍：將菌懸液倒入無菌的培養(yǎng)皿中，凍干的厚度大約為0.5 cm為宜。

真空冷凍干燥：冷凍干燥前先于-20 ℃預(yù)先冷凍12 h，然后于真空度10～20 Pa 條件下冷凍干燥24 h左右，讓冷凍干燥后菌粉的水分含量大約3%。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)響應(yīng)目標(biāo)為凍干后異常漢遜酵母存活率：在經(jīng)過Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)異常漢遜酵母存活率有影響的每個(gè)因素中篩選得到具有明顯作用的因素后，采用最陡爬坡法探究最大響應(yīng)區(qū)域。然后利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，通過所得到的數(shù)據(jù)獲得二階響應(yīng)面模型，從而最終確定異常漢遜酵母最優(yōu)凍干保護(hù)劑的配比。

1.3.3 測(cè)定方法

活菌計(jì)數(shù)方法：用0.9%的無菌生理鹽水致凍干粉復(fù)水達(dá)原體積。菌種計(jì)數(shù)方法：梯度稀釋平板法。

酵母存活率計(jì)算公式如下：

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

用Design-Expert 8.0軟件（StatEase Inc.，Minmeapolis，USA）和Minitab軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著影響因素

通過Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選脫脂乳、海藻糖、抗壞血酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸錳、谷氨酸鈉、木寡糖、甘油這8個(gè)因素[23]中對(duì)異常漢遜酵母存活率有明顯影響的因素，每個(gè)因素分別取2個(gè)水平，PB試驗(yàn)因素與水平見表1，結(jié)果見表2，各因素效應(yīng)分析見表3。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

由表3可知，此模型在0.05水平上足以擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)異常漢遜酵母存活率有明顯影響的因素為木寡糖、脫脂乳與海藻糖，剩余因素作用效果不顯著。故繼續(xù)探究此3個(gè)因素。脫脂乳、木寡糖、海藻糖的估計(jì)系數(shù)都是正值，對(duì)異常漢遜酵母存活率的影響都有顯著性正效應(yīng)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)分析Table 3 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

依據(jù)脫脂乳、木寡糖、海藻糖這3個(gè)因素效應(yīng)大小比例和其的方向決定最陡爬坡法的變化方向和步長(zhǎng)，它們的效應(yīng)都呈現(xiàn)正效應(yīng)，所以變化方向?yàn)檎蜃兓?。試?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Designs and results of the steepest experiments

由表4可知，第5組試驗(yàn)中異常漢遜酵母菌體的存活率最高，為81.12%。因此響應(yīng)面優(yōu)化研究試驗(yàn)中心點(diǎn)選擇為第5組試驗(yàn)中3因子水平。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 Box-Benhnken 設(shè)計(jì)及響應(yīng)面結(jié)果分析

以異常漢遜酵母菌體的存活率（Y）為響應(yīng)值，PB試驗(yàn)篩選出的木寡糖（A）、脫脂乳（B）、海藻糖（C）3個(gè)顯著因素為試驗(yàn)因素，依據(jù)最陡爬坡法的結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken 分析方案。確定了3因素3水平，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（5個(gè)中心點(diǎn)）的組合試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見表5，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6，響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見表7。

表5 異常漢遜酵母菌存活條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization of Hansenula anomala

利用Design-Expert 8.0軟件將表6中數(shù)據(jù)二次多元回歸擬合分析，獲得異常漢遜酵母菌體存活率對(duì)脫脂乳、海藻糖和木寡糖的二元多項(xiàng)式回歸方程為Y=+80.97+3.77A+3.14B+1.52C-2.07AB-3.33AC-3.19BC-3.93A2-4.25B2-3.80C2。

表6 異常漢遜酵母菌存活條件優(yōu)化Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization of Hansenula anomala

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation

由表7可知，模型F值105.577 6，P＜0.000 1說明此模型顯著。失擬向F值2.900 678，P=0.165 1＞0.05失擬向不顯著，說明此方程能夠體現(xiàn)實(shí)際問題。決定系數(shù)R2=0.992 7，說明此模型相關(guān)性良好。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.983 3，表明該模型能夠說明98.33%的響應(yīng)面值的變化。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為1%，信噪比為29.719，故可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)。方差分析的結(jié)果顯示，脫脂乳、海藻糖、木寡糖這3 個(gè)因素對(duì)于異常漢遜酵母菌體存活率影響作用均極其明顯，此3個(gè)因素對(duì)異常漢遜酵母菌體存活率的影響作用大小順次為木寡糖＞脫脂乳＞海藻糖。

通過軟件Design-Expert 8.0 繪制3個(gè)因素對(duì)異常漢遜酵母菌體存活率影響的等高線和響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，這3個(gè)響應(yīng)面在所定范圍之中均具有極值點(diǎn)，展現(xiàn)為開口向下的凸形球面。響應(yīng)面曲面圖直觀反映各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，曲面圖越陡表示交互作用越強(qiáng)，曲面圖越平則表示交互作用越弱。

圖1 脫脂乳、木寡糖和海藻糖添加量交互作用對(duì)菌體存活率影響的等高線及響應(yīng)曲面Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interactions between each factors on skim milk,xylooligosaccharide and trehalose on cell survival rate

依據(jù)此試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)研究后得到的異常漢遜酵母最優(yōu)凍干保護(hù)劑為脫脂乳21.8 g/100 mL，海藻糖11.6 g/100 mL，木寡糖0.6 g/100 mL，在此條件下預(yù)測(cè)到的菌體存活率為82.20%。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3組重復(fù)驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到平均菌體存活率實(shí)際值為82.11%，與試驗(yàn)預(yù)測(cè)值基本吻合，表明此數(shù)學(xué)模型精確可信。

3 結(jié)論

通過Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從8種保護(hù)劑中篩得對(duì)異常漢遜酵母（Hansenula anomala）的存活率有顯著作用的脫脂乳、木寡糖、海藻糖3種保護(hù)劑，這三種保護(hù)劑對(duì)異常漢遜酵母保護(hù)性能十分優(yōu)良。脫脂乳主要作用是在凍干過程中避免菌體表面受傷，讓溶液呈現(xiàn)過冷態(tài)，進(jìn)而減緩溶液結(jié)冰，在一定溫度下能減少細(xì)胞因脫水、鹽類濃縮帶來的傷害。木寡糖這種功能性聚合糖有優(yōu)良的穩(wěn)定性和保水性，能夠減少結(jié)晶。海藻糖可以在生物大分子失水的情況下用氫鍵相連失水點(diǎn)，產(chǎn)生保護(hù)膜替代所失的結(jié)構(gòu)水膜，還可以增進(jìn)玻璃體的生成，減弱冰晶生成避免其破壞蛋白質(zhì)和細(xì)胞。

根據(jù)PB篩選試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)，確立了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。在Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)方案和數(shù)據(jù)分析下創(chuàng)立二次多元數(shù)學(xué)模型，同時(shí)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析、響應(yīng)面分析和等高線分析，研究各因素之間的交互作用。分析得出，脫脂乳、海藻糖和木寡糖這3個(gè)因素對(duì)異常漢遜酵母菌體存活率的影響均極其明顯，脫脂乳和木寡糖的交互作用、脫脂乳和海藻糖的交互作用及海藻糖和木寡糖的交互作用都極其明顯。各因素對(duì)異常漢遜酵母菌體存活率的影響作用大小為木寡糖＞脫脂乳＞海藻糖。最終得出最優(yōu)保護(hù)劑配比：脫脂乳21.8 g/100 mL，海藻糖11.6 g/100 mL，木寡糖0.6 g/100 mL，菌體存活率預(yù)測(cè)值為82.20%，驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)際值為82.11%。表明此模型可信，為異常漢遜酵母的開發(fā)應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持，對(duì)酵母菌參與發(fā)酵東北酸菜改良酸菜品質(zhì)有推動(dòng)意義。