冶俊玲 茍笑丹 韓靜綺 郭新建 王豐梅 (青海大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，青海 西寧 810001)

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 是神經(jīng)生長因子家族的主要成員之一，對神經(jīng)元的生長，分化起著至關(guān)重要的作用〔1〕。但研究發(fā)現(xiàn)BDNF與酪氨酸蛋白激酶受體(Trk)B結(jié)合導(dǎo)致TrkB磷酸化從而激活細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和磷脂酶(PL)C等多條信號通路來參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移〔2,3〕。有研究顯示在肝癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤中BDNF和TrkB呈高表達(dá)，并且與疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系緊密，因此BDNF/TrkB可能作為腫瘤的生物治療的靶點(diǎn)〔4,5〕。但是國內(nèi)外關(guān)于BDNF和TrkB在食管癌中的表達(dá)，參與食管癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究報道較少。因此本研究分別在食管癌組織中檢測BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)，并檢測它們在食管癌細(xì)胞中的mRNA水平，分析兩者的表達(dá)與患者的臨床病理特征之間的聯(lián)系，同時觀察外源性BDNF對食管癌TE-1細(xì)胞增殖與侵襲的影響，探討B(tài)DNF和TrkB在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床上食管癌的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料 人食管癌細(xì)胞株ECA109、TE-1和正常食管永生化上皮細(xì)胞株HET-1A均購置于南京凱基生物。BDNF鼠抗人單克隆抗體、TrkB兔抗人多克隆抗體、辣根酶過氧化物標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司，外源性人重組BDNF蛋白購自美國Peprotech公司，由Invitrogen公司提供Trizol Reagent，MBI Fermentas公司提供逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴(kuò)增試劑盒，CCK8試劑盒購自南京凱基生物有限公司，Transwell小室購自美國corning公司。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本采集 選取2015年10月至2017年12青海大學(xué)附屬醫(yī)院食管癌手術(shù)切除標(biāo)本及對應(yīng)的癌旁組織各52例，其中男32例，女20例，年齡61～83歲，平均(69.28±5.74)歲，患者術(shù)前均未接受化療、放療等其他療法，組織標(biāo)本分別取自癌旁組織4 cm內(nèi)、無壞死癌灶及正常黏膜組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，脫水，包埋后連續(xù)切片，厚度4 μm，隨后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，經(jīng)專業(yè)病理科老師診斷確診為食管癌。高分化21例，中分化15例，低分化16例；浸潤深度：淺層19例，深層33例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期31例。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會的審批和認(rèn)可。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) ECA109和HET-1A使用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，TE-1使用含10%血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。

1.2.3食管癌組織及癌旁組織中BDNF和TrkB的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)兩步法檢測食管癌和對應(yīng)的癌旁組織中BDNF、TrkB的表達(dá)。染色步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書。一抗BDNF(1∶200)，TrkB (1∶250) 4℃過夜，采用DAB進(jìn)行染色，由蘇木素復(fù)染及分化。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定如下，BDNF和TrkB陽性表達(dá)均在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上呈棕黃色或黃色，隨機(jī)選取6個視野在400倍鏡下(Leica，德國)觀察，結(jié)合細(xì)胞著色深淺和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率進(jìn)行判定。(1)細(xì)胞著色深淺評分：陰性為0分；呈淺黃色為1分；呈棕黃色為2分；呈棕褐色為3分。(2)陽性細(xì)胞數(shù)百分率評分：0%～30%為1分，31%～70%為2分，71%～100%為3分。兩項評分的乘積大于或等于3分記為陽性表達(dá)，反之為陰性表達(dá)〔6〕。

1.2.4RT-PCR檢測ECA019、TE-1和HET-1A細(xì)胞中BDNF、TrkB mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑一步法提取對數(shù)生長期細(xì)胞中的RNA，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后擴(kuò)增成DNA(所有步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒說明書操作)。BDNF引物序列：上游：5-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3，下游：5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3；TrkB引物序列：上游：5-CCAAGAGGCTAAATCCAGTCC-3，下游：5-CCAGGTTACCAACATCCCAATA-3；以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列：上游：5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3；下游：5-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。引物序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RT-PCR條件如下：95℃預(yù)變性10 min，循環(huán)(95℃，30 s；50℃，30 s；：70℃，1 min)40次，最后70℃延伸10 min結(jié)束。制1%瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣后100 v電泳25 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)測定條帶灰度值，以目的基因(BDNF、TrkB)與內(nèi)參基因GAPDH灰度值的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5Western印跡檢測ECA019、TE-1和HET-1A細(xì)胞中BDNF、TrkB蛋白的表達(dá) 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS清洗2遍后，加入預(yù)冷的RIPA試劑提取細(xì)胞中的總蛋白。采用BCA法對提取的總蛋白進(jìn)行蛋白的定量。配置濃縮膠，分離膠，取20 μg總蛋白點(diǎn)樣，分離總蛋白后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，加入鼠抗人BDNF單克隆抗體(1∶2 000)或兔抗人TrkB多克隆抗體(1∶1 500)4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影。檢測蛋白條帶光密度值。

1.2.6CCK8檢測外源性BDNF對食管癌細(xì)胞的增殖情況 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至4×105～5×105個/ml。于96孔板每孔中加入100 μl細(xì)胞懸液，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中放置24 h后待細(xì)胞完全貼壁。分別加入含20、40、80、160 ng/ml BDNF的1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，加入不含BDNF的1%血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為0 ng/ml BDNF濃度對照，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d時，向每孔中加入10 μl的CCK8試劑，搖床上輕搖1 min后放置于培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)1 h，BIO-RAD680酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長處各組的吸光度值(即OD值)，以每組復(fù)孔的平均值作為該組的OD值。

1.2.7Transwell檢測外源性BDNF對食管癌細(xì)胞的侵襲情況 首先培養(yǎng)基潤洗Transwell小室1遍，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配置基質(zhì)膠至濃度為10 μg/μl，取50 μl均勻鋪于小室上面，37℃培養(yǎng)箱中放置1 h確認(rèn)凝固后加入無血清培養(yǎng)基重懸后的細(xì)胞200 μl，細(xì)胞數(shù)量控制在1×104個左右。將實驗分為實驗組和對照組，實驗組下室內(nèi)加入含80 ng/ml BDNF的培養(yǎng)基，對照組下室中則加入不含BDNF的培養(yǎng)基。藥物處理24 h后，取出小室置于甲醇中固定20 min，將小室倒置風(fēng)干后，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗2遍后用棉簽擦拭小室基質(zhì)膠上面殘留的細(xì)胞。于倒置顯微鏡(Leica，德國)下觀察Transwell小室，100倍鏡下隨機(jī)選取6～8個視野計數(shù)的平均值作為穿過基底膜的平均細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1BDNF和TrkB在食管癌組織中的表達(dá) BDNF和TrkB陽性主要表達(dá)在食管癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上，陽性部分呈現(xiàn)棕黃色或黃色。食管癌組織標(biāo)本中，BDNF、TrkB的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。

圖1 BDNF在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá) (SP，×400)

圖2 TrkB在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá) (SP，×400)

2.2食管癌組織中BDNF和TrkB的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 食管癌組織中BDNF和TrkB的表達(dá)與患者的性別和年齡無顯著相關(guān)性(P>0.05)；與腫瘤浸潤深度、TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(均P<0.05)。見表2。

表1 BDNF和TrkB在食管癌組織及癌旁組織中的陽性表達(dá) 〔n(%),n=52〕

2.3不同食管細(xì)胞中BDNF和TrkB mRNA的表達(dá) 食管癌細(xì)胞ECA109和TE-1中BDNF及TrkB mRNA的表達(dá)明顯高于食管正常細(xì)胞HET-1A(P<0.05)。見表3。

2.4不同食管細(xì)胞中BDNF和TrkB蛋白的表達(dá) 食管癌細(xì)胞ECA109和TE-1中，BDNF和TrkB蛋白的表達(dá)顯著高于食管正常細(xì)胞HET-1A。見表4和圖3。

表2 BDNF和TrkB的表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

表3 不同食管細(xì)胞中BDNF和TrkB mRNA的表達(dá)

與HET-1A比較：1)P<0.05；表4同

表4 不同食管細(xì)胞中BDNF和TrkB蛋白的表達(dá)

圖3 不同食管細(xì)胞中BDNF和TRKB蛋白的表達(dá)

2.5BDNF影響食管癌細(xì)胞TE-1的增殖 在第1天、第2天，不同濃度BDNF的細(xì)胞OD值變化不明顯，第3、4、5天，40、80和160 ng/ml濃度BDNF的細(xì)胞OD值明顯高于0 ng/ml BDNF濃度(P<0.05)，20 ng/ml和0 ng/ml BDNF濃度的細(xì)胞OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

培養(yǎng)時間0 ng/ml20 ng/ml40 ng/ml80 ng/ml160 ng/ml第1天0.51±0.040.53±0.060.52±0.050.54±0.070.62±0.09第2天0.72±0.080.75±0.070.79±0.110.76±0.080.80±0.12第3天0.98±0.121.02±0.141.28±0.151)1.31±0.141)1.52±0.171)第4天1.16±0.171.17±0.191.46±0.191)1.52±0.171)1.87±0.191)第5天1.35±0.201.39±0.181.95±0.221)2.02±0.211)2.24±0.211)

與同時間點(diǎn)的0 ng/ml 比較：1)P<0.05

2.6BDNF影響食管癌細(xì)胞TE-1的侵襲能力 實驗組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)目〔(952.21±165.39)個〕顯著高于對照組〔(206.24±12.67)個,P<0.05〕。見圖4。

圖4 BDNF對食管癌TE-1細(xì)胞侵襲能力的影響(×100)

3 討 論

食管癌是消化道中最常見的腫瘤之一，近些年食管癌在全球的發(fā)病率和死亡率急劇上升〔7〕。目前治療食管癌的手段還是首選手術(shù)切除，但是由于食管癌的具有高侵襲，高轉(zhuǎn)移的生長特性導(dǎo)致患者治療效果和預(yù)后不佳〔8，9〕。因此，尋找與食管癌生長特性相關(guān)的新靶點(diǎn)，深入對食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究可能，改善患者的預(yù)后，對臨床治療具有重要意義。

研究顯示，BDNF能夠與高親和力的受體TrkB結(jié)合參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔10～12〕。魏秀娟等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)，在舌鱗癌組織中BDNF和TrkB的表達(dá)率遠(yuǎn)高于在正常舌黏膜組織。有研究報道在子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌組織中BDNF和TrkB呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜組織中兩者的表達(dá)率很低甚至不表達(dá)，并且BDNF和TrkB的表達(dá)與患者子宮內(nèi)膜的病變關(guān)系密切〔14〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中BDNF和TrkB的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并且對食管癌患者的相關(guān)病理特征分析得出BDNF和TrkB與腫瘤的組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，提示BDNF、TrkB可能參與了食管癌的增殖與轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)食管癌TE-1細(xì)胞的增殖遷移能力高于食管癌ECA109細(xì)胞〔15〕。而本研究在mRNA和蛋白水平分別檢測了兩種食管癌細(xì)胞株ECA109和TE-1中BDNF、TrkB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB在TE-1細(xì)胞系中的表達(dá)高于ECA109，提示BDNF和TrkB可能調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。研究表明〔16，17〕，在大鼠肝癌模型中外源性BDNF可以通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白HSP90刺激細(xì)胞內(nèi)源性BDNF分泌增加，促進(jìn)腫瘤的增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，外源性BDNF能夠結(jié)合磷酸化細(xì)胞表面的TrkB受體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔18，19〕。本研究通過外源性BDNF刺激BDNF/TrkB信號軸，觀察BDNF對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，隨著外源性BDNF處理濃度的增加和處理時間的延長，TE-1細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，具有劑量時間依賴性。在眾多BDNF與其他惡性腫瘤的研究中同樣發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果，推測BDNF可能是通過激活TrkB受體，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力〔20〕。Transwell實驗結(jié)果顯示，外源性BDNF能夠增加TE-1細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量，使其侵襲能力增強(qiáng)。因此BDNF/TrkB可能作為食管癌治療的新靶點(diǎn)。但是有關(guān)BDNF/TrkB調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，食管癌組織中BDNF、TrkB異常高表達(dá)，且BDNF/TrkB在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有可能成為抗癌治療的新靶點(diǎn)。