劉延波 張麗婷 趙志軍 王賢 孫西玉 潘春梅

摘要： 從賒店老酒大曲中分離篩選得到1株在60 ℃仍能生長的霉菌，將其命名為B8。對該菌株進行菌落形態(tài)觀察和種屬鑒定，確定其為根霉菌（Rhizopus），最適生長溫度為45 ℃。以該菌株為出發(fā)菌株，通過單因素試驗測定其糖化酶活力和液化酶活力，結(jié)合響應面分析法優(yōu)化其培養(yǎng)條件，測得其糖化酶活力在料水比為5 g ∶3 mL、氮源添加量為0.4%、培養(yǎng)時間為5 d時最高，經(jīng)試驗驗證酶活力達到162.38 U/g，與預測值基本接近;液化酶活力在料水比為5 g ∶3 mL、氮源添加量為0.4%、培養(yǎng)時間為5 d時最高，經(jīng)試驗驗證酶活力達到41.57 U/g，與預測值基本接近。

關鍵詞： 賒店老酒;大曲;霉菌;耐高溫;液化酶;糖化酶;響應面回歸方程;產(chǎn)酶條件

中圖分類號：S182;TS262.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0268-08

白酒的產(chǎn)量與品質(zhì)主要取決于大曲中微生物的協(xié)同參與作用[1-2]，而在大曲的真菌群落中，霉菌是很重要的一類微生物[3]。一方面，霉菌為其他微生物提供生長因子;另一方面，霉菌產(chǎn)生的淀粉酶對白酒釀造有至關重要的作用[4-5]。淀粉酶主要包括液化酶和糖化酶，對淀粉的水解能力極強[6-8]。

在制曲過程中，中高溫大曲溫度達到60 ℃以上時，將大量耐熱性差的微生物淘汰，相當于一個富集嗜熱菌的過程[9]。而嗜熱功能霉菌對白酒的風味起著重要的作用，具有重要的研究價值[10]。目前關于白酒大曲中耐高溫細菌的研究較多，如葛媛媛等從高溫大曲中篩選出85株可以耐受55 ℃溫度的嗜熱細菌[11]，周瑞平等從偏高溫大曲中篩選出可耐受72 ℃高溫的嗜熱細菌[12];而對濃香型白酒中高溫大曲中耐高溫霉菌的研究較少。因此，本研究以賒店老酒的中高溫大曲為試驗材料篩選得到耐高溫霉菌，并對其產(chǎn)酶條件進行研究，以期揭示制曲過程和釀酒規(guī)律，為后期運用優(yōu)勢菌優(yōu)化白酒生產(chǎn)工藝、提高白酒出酒率提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料和試劑 試驗材料：賒店老酒股份有限公司的中高溫大曲。

培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基）;孟加拉紅培養(yǎng)基;麩皮培養(yǎng)基。

0.2 mol/L醋酸緩沖液：稱取乙酸鈉13.4 g，以蒸餾水溶解，加入冰醋酸5.2 mL，定容于1 000 mL容量瓶中，搖勻，pH 值4.6。

2%可溶性淀粉：稱取2 g淀粉，加入少量煮沸后的蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入約50 mL煮沸的蒸餾水，攪拌均勻，再煮沸1 min，冷卻，加入10 mL 0.2 mol/L 乙酸緩沖液，于容量瓶中定容至100 mL。

DNS試劑：稱取3，5-二硝基水楊酸10 g，置于約600 mL水中，逐漸加入NaOH 10 g，在50 ℃水浴鍋中攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉200 g、苯酚2 g、無水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL，過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

工作碘液：500 mg I2和5 g KI溶于100 mL水中，即為貯藏碘液，取1 mL貯藏碘液稀釋至100 mL即為工作碘液。

1.1.2 儀器和設備 SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;752型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）;水浴鍋（山東方科儀器有限公司）;振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）;GH-500ASB型隔水式培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）;LDZX-50KBS型高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 霉菌的分離純化

稱取10 g大曲研磨，在無菌條件下加入到90 mL無菌水中，150 r/min充分振蕩30 min。取上清液1 mL即為10-1稀釋度，加入9 mL的無菌水中制成10-2稀釋度，重復此步驟，直到稀釋度為10-7。吸取各稀釋度100 μL涂布于已經(jīng)凝固的PDA培養(yǎng)基上，1個梯度做3個平行。30 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d，完成初步分離。將得到的菌株用平板劃線法進行純化，純化2～3次即可得到純菌落。鏡檢[13]，于孟加拉紅斜面培養(yǎng)基試管中 4 ℃ 保藏。

1.2.2 耐高溫霉菌的篩選

將保藏的霉菌分別接種到平板上，置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，緩慢將培養(yǎng)溫度升高并將菌株繼續(xù)轉(zhuǎn)接，分別于40、45、50、55、57、60 ℃溫度下培養(yǎng)3～5 d，直到獲得最耐高溫的菌株[14]。每株菌做3個平行。

1.2.3 菌株18S rDNA分析[15]

用Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，真菌核糖體rRNA區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應試劑：SanTaq PCR Mix預混液、ddH2O、marker，生工生物工程（上海）股份有限公司。真菌核糖體擴增引物為通用引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應體系為 50 μL（SanTaq PCR Mix預混液25 μL，引物各 2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL）。

PCR擴增條件：94 ℃ 6 min;94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 120 s，30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，然后在NCBI上通過BLAST程序進行同源性比較與分析。采用MEGA 6.0軟件作系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 酶活的測定方法

1.2.4.1 液化酶活力：YOO改良法[16]

酶活力定義：于40 ℃下，5 min內(nèi)水解1 mg淀粉（0.5%淀粉）的酶量為1個活力單位，以“U/g”表示。

1.2.4.2 糖化酶活力：DNS法[17]

葡萄糖標準曲線如圖1所示。

酶活力定義：于40 ℃下、pH 值為4.6的條件下，每1 h水解淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖作為1個酶活力單位，以“U/g”表示。

1.2.5 耐高溫霉菌的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.2.5.1 不同料水比對菌株酶活的影響

以麩皮和不同水分混合制成麩曲，為菌株生長提供物質(zhì)基礎，菌株在不同料水比麩曲中培養(yǎng)其產(chǎn)酶活力也不同。選取分離得到的耐高溫菌株，設置料水比為 5 g ∶1 mL、5 g ∶2 mL、5 g ∶3 mL、5 g ∶4 mL、5 g ∶5 mL，將料水混合均勻[18]，配制好麩皮培養(yǎng)基以相同的量分裝到三角瓶中，0.1 MPa滅菌20 min，冷卻后接種，每隔12 h進行1次搖瓶，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。干燥10 h后以pH值為7.5的磷酸緩沖溶液浸提1 h配制成粗酶液[19]，對其進行液化酶活力和糖化酶活力的測定。

1.2.5.2 不同氮源添加量對菌株酶活力的影響

在麩曲中加入（NH4）2SO4不僅為菌株生長提供氮源，且對菌株生長環(huán)境中pH值也有一定的影響。因此本試驗選?。∟H4）2SO4作為氮源，分別以0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%進行試驗[20]，以最適料水比配制麩皮培養(yǎng)基，并以相同的量分裝到三角瓶中，0.1 MPa 滅菌20 min，冷卻后接種，每隔12 h進行1次搖瓶，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d，干燥10 h后以pH值為7.5的磷酸緩沖溶液浸提1 h配制成粗酶液，對其進行液化酶活力和糖化酶活力的測定。

1.2.5.3 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活的影響

以最適料水比和最適氮源添加量配制麩皮培養(yǎng)基，并以相同的量分裝到三角瓶中，0.1 MPa滅菌20 min，冷卻后接種，每隔12 h進行1次搖瓶，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)后3 d開始取樣測酶活，直到培養(yǎng)后7 d。

1.2.6 響應面試驗

在前期單因素試驗的基礎上選取3個影響因素，以酶活力為因變量，利用DesignExpert 8.0.6軟件設計Box-Behnken試驗，分別確定產(chǎn)糖化酶和液化酶的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進行試驗驗證[21]。利用Design-Expert 8.0.6軟件對二次響應面回歸模型作出相應的響應曲面[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1? ?耐高溫菌株篩選結(jié)果

從賒店老酒大曲中分離篩選得到霉菌200株，通過耐高溫試驗最終獲得1株霉菌B8。B8菌株在60 ℃ 時仍能生長，且最適生長溫度為45 ℃。B8菌株菌落形態(tài)如圖2所示。

由圖2可知，B8菌株的菌落培養(yǎng)特征為：蔓延迅速，初為白色，后逐漸變?yōu)楹诤稚?，透明性差。菌絲無隔膜，假根發(fā)達，分枝呈指狀，孢子囊呈球形或近球形。

2.2? 分子生物學鑒定結(jié)果

利用特異性引物對B8的18S rDNA片段進行擴增，然后進行凝膠電泳。由圖3可以看出，擴增所得ITS序列長度約為574 bp，特異性好，與預期結(jié)果相符。

將所得B8菌株574 bp ITS序列在NCBI網(wǎng)站上通過BLAST程序進行同源性比較與分析。取與B8菌ITS序列一致性在99%以上的序列，用MEGA 6.0進行多序列比對并構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖4。結(jié)合生理生化試驗表明菌株B8屬于根霉屬（Rhizopus）。

2.3 單因素條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 不同料水比對菌株酶活的影響 由圖5可知，B8產(chǎn)液化酶和糖化酶活力的能力具有同步性，都是隨著水分的增多酶活力先慢慢升高再降低，即當水分含量過低或過高時，2種酶活力都比較低，而當料水比為5 g ∶3 mL時，2種酶活力最高，此時液化酶活力達到30.55 U/g，糖化酶活力達到 163.66 U/g。在制作麩曲中，水分是很重要的因素，過多或過少都會抑制菌株活力。因此，選擇最佳料水比5 g ∶3 mL做后續(xù)試驗。

2.3.2 不同氮源添加量對菌株酶活的影響 由圖6可知，液化酶活力和糖化酶活力隨著添加量的增多而升高，當?shù)刺砑恿窟_0.4%時2種酶活都達到最大值，此時液化酶活力為29.88 U/g， 糖化酶活力為142.34 U/g。之后隨著添加量的增多，2種酶活力都呈下降趨勢，過量的氮源添加量會使pH值超過菌株的正常生長范圍。因此，選擇0.4%氮源為最佳添加量做后續(xù)試驗。

2.3.3 不同培養(yǎng)時間對菌株酶活的影響 以料水比為5 g ∶3 mL，氮源添加量為0.4%制作麩曲培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種，從培養(yǎng)后3 d開始測酶活。由圖7可知，液化酶活力在培養(yǎng)后3～5 d呈上升趨勢，培養(yǎng)后5 d達到酶活最大值，為33.14 U/g;之后隨著培養(yǎng)時間的增加、培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及水分的減少，酶活力下降。糖化酶活力也是在培養(yǎng)后3～5 d逐漸上升，培養(yǎng)后4～6 d的酶活力相差甚小，分別是172.23、175.51 U/g，培養(yǎng)后5 d酶活達到最大值;之后呈下降趨勢。因此，最佳培養(yǎng)時間選擇 5 d 做后續(xù)試驗。

2.4 糖化酶活力響應面試驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken設計與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[24]，設計17個試驗點的響應面分析試驗，以菌株的糖化酶活力作為響應值，選取A含水量（為了便于響應面分析數(shù)據(jù)的處理，料水比以下均采用水的百分含量表示，料水比 5 g ∶2 mL、5 g ∶3 mL、5 g ∶4 mL分別對應含水量29%、38%、44%）、B氮源添加量、C培養(yǎng)時間3個具有顯著影響的因素作為自變量，試驗因素的水平選取：含水量29%、38%、44%，氮源添加量0.1%、0.4%、0.7%，培養(yǎng)時間4、5、6 d，試驗設計與結(jié)果如表1所示。