馬麥艷 陳方圓 張相鋒 焦子偉

摘要： 近年，隨著人工栽培蛹蟲草面積逐年擴(kuò)大，迫切需求大規(guī)模培育蛹蟲草菌種，尤其是液體菌種來滿足日益擴(kuò)大的再生產(chǎn)的需要。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取pH值、溫度、通氣量3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，進(jìn)行液體菌種發(fā)酵工藝試驗(yàn)，分析蛹蟲草子實(shí)體生長影響及生物轉(zhuǎn)化率變化情況。通過試驗(yàn)得到人工栽培蛹蟲草液體菌種發(fā)酵的最佳組合條件。不同處理對(duì)蛹蟲草子實(shí)體生長有明顯變化，3種因素對(duì)蛹蟲草的生物轉(zhuǎn)化率影響為：溫度>通氣量>pH值，其最優(yōu)組合為溫度20 ℃、pH值5.5、通氣量2 L/min。

關(guān)鍵詞： 蛹蟲草;子實(shí)體;液體發(fā)酵;工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S567.3+50.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0143-05

近年來，由于野生蟲草（Cordyceps militaris）過度開采造成產(chǎn)量急劇下降且使其生長環(huán)境遭到破壞，人工栽培蛹蟲草面積逐年擴(kuò)大，這就迫切需求大規(guī)模培育蛹蟲草菌種，尤其是液體菌種來滿足日益擴(kuò)大的再生產(chǎn)的需要。國外已進(jìn)行了蛹蟲草人工栽培相關(guān)技術(shù)的研究，采用仿生栽培、固體培養(yǎng)基栽培、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)等多種方式進(jìn)行了人工培養(yǎng)并得到了蛹蟲草的子實(shí)體[1-2]。深層發(fā)酵技術(shù)目前已運(yùn)用到食品、藥劑等產(chǎn)品生產(chǎn)方面，Kitakaze等和Vinadé等在蛹蟲草液體培養(yǎng)方面做了大量的工作[3-4]。國內(nèi)學(xué)者對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究，任昕雯等以大米、啤酒糟共培養(yǎng)的蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件研究了液體發(fā)酵條件對(duì)蛹蟲草產(chǎn)蟲草素的影響[5]。張楠等對(duì)蛹蟲草深層發(fā)酵產(chǎn)蟲草素培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化[6]。秦鵬等研究了不同添加物對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草素的影響，確定了3種生長素使用的最佳質(zhì)量濃度，并對(duì)各質(zhì)量濃度下蛹蟲草生長情況進(jìn)行了分析與討論[7]。蛹蟲草液體發(fā)酵相關(guān)研究大多是針對(duì)其某一影響因素進(jìn)行了探討，但針對(duì)蛹蟲草菌種資源用于液體發(fā)酵的研究仍較少。結(jié)合新疆伊犁當(dāng)?shù)貙?shí)際，本研究利用新疆蛹蟲草菌種，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取pH值、溫度、通氣量3個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，研究液體菌種發(fā)酵對(duì)蛹蟲草產(chǎn)子實(shí)體生長的影響，分析蛹蟲草生長情況及生物轉(zhuǎn)化率。進(jìn)一步掌握蛹蟲草液體菌種擴(kuò)大發(fā)酵的最佳工藝條件，提供優(yōu)質(zhì)蛹蟲草液體發(fā)酵菌種，滿足伊犁乃至新疆地區(qū)大面積規(guī)?；斯ぴ耘嘤枷x草的需要。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株均來源于筆者實(shí)驗(yàn)室，人工篩選獲得的MAT1-1和MAT1-2不同交配型代表菌株[8]。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

改良PDA固體培養(yǎng)基：參照努爾買買提[9]等所述方法。

改良PD液體培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2 g、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O） 1 g和復(fù)合維生素B 25 mg，pH值6.5～7.0。

種子發(fā)酵培養(yǎng)基采用改良PD液體培養(yǎng)基。

1.1.3 供試培養(yǎng)設(shè)備與介質(zhì)

Liflus GX多功能生物發(fā)酵系統(tǒng)、組培玻璃瓶（規(guī)格：350 mL，高108 mm，直徑75 mm，口徑69 mm）、人工栽培基質(zhì)大米等。

1.2 液體菌種發(fā)酵

1.2.1 種子液制備

將不同遺傳交配型代表菌株無菌接種至改良PDA培養(yǎng)基，于21 ℃下恒溫光照培養(yǎng)15 d后，用滅菌牙簽挑取分生孢子，接種至含有50 mL改良PD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，170 r/min，21 ℃恒溫下?lián)u培3～4 d后備用。

1.2.2 發(fā)酵罐調(diào)試與滅菌

進(jìn)行溶氧電極（INPRO6800）準(zhǔn)備;按照要求配制不同pH值校準(zhǔn)液對(duì)pH值電極405-BPASPH值進(jìn)行校準(zhǔn);將每個(gè)相關(guān)部件都安裝到發(fā)酵罐對(duì)應(yīng)位置上，121 ℃下滅菌20～30 min，再快速移至無菌操作臺(tái)下備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下先倒入滅菌的PD培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，將不同遺傳交配型的種子液等體積混合，再按發(fā)酵液體培養(yǎng)基 ∶種子液=（10～15） ∶1（體積比）的比例，加入適量的混合種子液于發(fā)酵罐中;開通各個(gè)電源，通過蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)條件的酸、堿量;按不同處理的發(fā)酵條件分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每個(gè)處理培養(yǎng)3～4 d，當(dāng)發(fā)酵罐中菌絲球布滿培養(yǎng)液時(shí)發(fā)酵完成。

1.2.4 發(fā)酵液保存

將不同處理的發(fā)酵液體菌種無菌條件下倒入已滅菌的玻璃容器內(nèi)現(xiàn)用，或放入4 ℃冰箱暫時(shí)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工栽培

1.3.1 栽培培養(yǎng)基滅菌

參照努爾買買提等的方法[9]，每個(gè)組織培養(yǎng)瓶裝入20 g大米，加入15 mL改良PD培養(yǎng)基，搖均加蓋后放入大滅菌鍋內(nèi)，115 ℃ 下滅菌3 h后備用。

1.3.2 人工培養(yǎng)

無菌條件下分別吸取7.5 mL不同處理的發(fā)酵液體菌種接種于每瓶栽培培養(yǎng)基中，并將接種好的不同處理的組織培養(yǎng)瓶放置于（21±1） ℃的人工栽培室培養(yǎng)架上培養(yǎng)55～60 d，直至蛹蟲草子實(shí)體成熟。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種100瓶。

1.3.3 觀測(cè)與分析

定期對(duì)不同處理的蛹蟲草菌絲體、子實(shí)體生長情況進(jìn)行觀測(cè)，并對(duì)不同處理所收獲的蛹蟲草子實(shí)體長度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、生物轉(zhuǎn)化率以及產(chǎn)量等指標(biāo)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取pH值（A）、溫度（B）、通氣量（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，即3因素3水平進(jìn)行優(yōu)化，計(jì)9個(gè)處理（表1）。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值為依據(jù)，采用Excel軟件、SPSS軟件（Version 11.5，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和正交分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長分析

通過對(duì)不同發(fā)酵條件處理的蛹蟲草菌絲生長情況進(jìn)行觀察與記錄，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。不同處理經(jīng)接菌、人工栽培后，剛開始各處理的蛹蟲草菌絲生長情況均表現(xiàn)較好態(tài)勢(shì)，接種后3～5 d蛹蟲草菌絲體布滿整個(gè)培養(yǎng)基質(zhì)，呈白色。但隨時(shí)間推移，不同處理的蛹蟲草菌絲在菌絲密度、菌絲轉(zhuǎn)色及菌餅變黃時(shí)間情況開始出現(xiàn)明顯差異。其中，處理1、處理4組蛹蟲草菌絲密度最好，菌絲轉(zhuǎn)成橘黃色速度最快，菌餅變黃時(shí)間最短，為9 d;處理2、3、5、8、9組蛹蟲草菌絲密度較好，變黃時(shí)間短及菌絲轉(zhuǎn)成橘黃色速度較快;處理6、7組蛹蟲草菌絲密度最差，菌絲轉(zhuǎn)成橘黃色速度慢且菌餅變黃時(shí)間最長，為12 d（表2）。

2.2 蛹蟲草子實(shí)體生長分析

對(duì)不同處理的蛹蟲草子實(shí)體生長情況進(jìn)行觀察與記錄，獲得相關(guān)結(jié)果。不同處理的蛹蟲草子實(shí)體生長及生物學(xué)指標(biāo)各不相同。除處理6和處理7外，其他各處理的蛹蟲草子實(shí)體均生長良好。其中，處理1及處理4組表現(xiàn)最好，子實(shí)體形成時(shí)間最早、子座粗長、均勻、子實(shí)體正常，橘紅色、有子囊殼、出草質(zhì)量好;處理2、3、5、8、9組均表現(xiàn)較好，出草時(shí)間較早、子座較粗長、均勻、子實(shí)體較正常，橘紅色、有子囊殼、出草質(zhì)量較好;處理6和處理7出草較晚、子座粗而短、僅部分出草，橘紅色、出草質(zhì)量一般（表3、圖1）。

2.3 蛹蟲草出草比較

待子實(shí)體成熟后，對(duì)不同處理蛹蟲草子實(shí)體的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行記錄分析，可以看出不同處理蛹蟲草在子實(shí)體長度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、鮮干比和生物轉(zhuǎn)化率方面均呈顯著性差異（P<0.05）。

其中，處理4蛹蟲草的各項(xiàng)指標(biāo)最好，子實(shí)體平均長度為6.01 cm、鮮質(zhì)量為10.19 g、干質(zhì)量為1.48 g、鮮干比為7.02、生物轉(zhuǎn)化率為50.93%;處理1蛹蟲草的各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)略次于處理4，除鮮質(zhì)量、鮮干比及生物轉(zhuǎn)化率指標(biāo)外，子實(shí)體長度和干質(zhì)量指標(biāo)均低于處理4，且呈顯著性差異;處理6和處理7蛹蟲草的各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)較差，這2個(gè)處理之間除子實(shí)體長度呈顯著性差異外，其他指標(biāo)如鮮干質(zhì)量、鮮干比、生物轉(zhuǎn)化率方面未呈現(xiàn)顯著性差異（表4）。

由表4可知，不同處理在子實(shí)體長度、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、鮮干比和生物轉(zhuǎn)化率方面均有差異。圖2以生物轉(zhuǎn)化率為例，發(fā)現(xiàn)不同處理的蛹蟲草生物轉(zhuǎn)化率均有差異。其中，處理4組表現(xiàn)最好，生物轉(zhuǎn)化率最高，為50.93%;處理1、2、3、5、8、9組生物轉(zhuǎn)化率較高;處理6和處理7生物轉(zhuǎn)化率較低，分別為11.23%和16.4%。

以生物轉(zhuǎn)化率為例對(duì)不同處理的蛹蟲草子實(shí)體數(shù)據(jù)進(jìn)行正交分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵條件對(duì)蛹草菌生物轉(zhuǎn)化率影響為：溫度（B）>通氣量（C）>pH值（A），3個(gè)因素均不顯著（P<0.05）。最優(yōu)組合為A1B1C2，即溫度20 ℃，pH值5.5，通氣量2 L/min（表5、表6）。

3 討論

目前，國外在蛹蟲草液體深層發(fā)酵方面也進(jìn)行了摸索[10-12]，并取得了一定的成果。國內(nèi)大都對(duì)其液體發(fā)酵某一影響因素進(jìn)行相關(guān)研究，如楊杰等研究以蛹蟲草菌絲生物量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)從裝液量、通氣量、發(fā)酵起始pH值和接種量4個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明裝液量為35 L/罐，通氣量為0.9 m3/h，起始pH值6.45，接種量20瓶（每瓶 500 mL）/罐（60 L）為最佳[13]。周廣麒等研究發(fā)現(xiàn)使用30 L大型生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵菌絲體，通氣量為1.21 m3/h較好[14]，與楊杰等研究的結(jié)果[13]相似。本研究采用3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同處理對(duì)蛹蟲草生長有一定的影響，不同溫度、不同pH值和不同通氣量對(duì)蛹蟲草子實(shí)體生長有明顯影響，3種因素對(duì)蛹蟲草子實(shí)體的生物轉(zhuǎn)化率影響為：溫度（B）>通氣量（C）>pH值（A），其最優(yōu)組合為溫度20 ℃、pH值5.5、通氣量2 L/min。進(jìn)一步明確了蛹蟲草液體菌種發(fā)酵的不同影響因素和最佳工藝條件，這為蛹蟲草液體發(fā)酵技術(shù)提供了技術(shù)依據(jù)和支撐。當(dāng)然不同體積的發(fā)酵罐，以及在不同小試、中試生產(chǎn)階段對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵工藝條件均有影響，還需要以此為基礎(chǔ)做進(jìn)一步分析與研究。此外，還需要對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)液體發(fā)酵與接種有機(jī)統(tǒng)一，節(jié)本增效，用于規(guī)?；a(chǎn)。

4 結(jié)論

采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行了蛹蟲草液體菌種發(fā)酵工藝優(yōu)化，3個(gè)因素影響其生物轉(zhuǎn)化率順序?yàn)闇?度> 通氣量>pH值，得到了最優(yōu)發(fā)酵組合條件，即最優(yōu)組合為A1B1C2，即溫度20 ℃，pH值5.5，通氣量2 L/min。

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收 稿日期：2019-01-17

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（編號(hào)：2017E0239）。

作者簡介：馬麥艷（1994—），女，新疆霍城人，碩士研究生，研究方向?yàn)槿斯び枷x草栽培與示范。E-mail：1034277602@qq.com。

通信作者：張相鋒，碩士，講師，研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)，E-mail：759737497@qq.com;焦子偉，博士，教授，研究方向微生物生態(tài)及綠色有機(jī)農(nóng)業(yè)有害生物防控，E-mail：741285332@qq.com。