左曉昕 趙艷紅 鄧碧華 牟和平 胡來根 宋偉 呂芳 盧宇 侯繼波

摘要： 豬瘟疫苗真空冷凍干燥工藝，可減少凍干對制品活性的影響，降低制品凍干過程的耗能，縮短凍干周期，故研制安全、耐熱、節(jié)能的豬瘟減毒凍干疫苗極為重要。選用甘露醇、甘氨酸等成分設計豬瘟耐熱保護劑配方，通過間接免疫熒光法比較制品在37 ℃、10 d的凍干和耐熱損失，并用兔體熱反應法復核。檢測優(yōu)化配方的共晶點和塌陷溫度設計凍干程序，比較不同預凍方式對豬瘟耐熱疫苗凍干的影響，調整凍干周期。豬瘟耐熱保護劑配方A-4的凍干和耐熱損失最小，分別為0.30 lg和0.45 lg。根據(jù)制品的共晶點-27.51 ℃，對預凍方式篩選，發(fā)現(xiàn)快凍凍干和耐熱損失最小，分別為0.17 lg和0.38 lg，根據(jù)塌陷溫度-24.3 ℃，成功將凍干曲線縮短至24 h。調整后的配方可使豬瘟活苗在 37 ℃ 保存 15 d、45 ℃保存7 d;內(nèi)毒素和動物試驗表明該疫苗安全、無副反應。上述結果表明，試驗成功篩選出豬瘟耐熱保護劑配方A-4，在保證疫苗質量的前提下優(yōu)化凍干曲線，調整后的保護劑配方保證疫苗耐熱性能，安全無副反應。

關鍵詞： 豬瘟病毒;耐熱保護劑配方;凍干工藝;耐熱性能;安全性

中圖分類號： S859.79+7? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0156-06

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的急性、接觸性傳染病，在各國均有暴發(fā)疫情，尤其是東南亞地區(qū)，呈散發(fā)性且流行范圍廣的特點[1]。豬瘟作為我國重大動物疫病，已經(jīng)在國家中長期動物疫病防治規(guī)劃中被列為優(yōu)先防治的動物疫病[2]。

疫苗是控制豬瘟的重要手段，我國相繼用4株豬瘟病毒誘導豬瘟發(fā)病，并成功篩選出能夠減少對豬的致病能力但能保存免疫原性的豬瘟病毒，即豬瘟兔化弱毒疫苗C株。CSFV增殖方法多樣，目前在生產(chǎn)上多在豬睪丸細胞和牛睪丸原代細胞上擴繁，生產(chǎn)工藝成熟。但是該疫苗的耐熱性差，極易失活[3]，在生產(chǎn)后期必須要添加一些保護劑，并進行真空冷凍干燥。但是，目前市場上的豬瘟凍干活疫苗在傳輸中仍無法脫離冷鏈環(huán)境，需要在 -15 ℃ 以下保存[4]，現(xiàn)有疫苗的凍干工藝周期較長，一般在42～50 h，極大增加生產(chǎn)的成本[5]。在近期研究中，有報道指出，蔗糖、甘氨酸、表面活性劑等復合組方能夠延長腺病毒在4 ℃和室溫的保存期[6-7];使黃熱病毒在4 ℃下可保存11周左右[8]。該復合組方在豬瘟活疫苗上也有應用，使用甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖等能夠使疫苗在2～8 ℃保存2年，在37 ℃保存10 d耐熱損失在0.9 lg，該復合組方安全、無副反應，避免了外源蛋白給動物帶來的過敏反應[9-10]，但目前這些配方對不同細胞培養(yǎng)的CSFV保護效果報道較少。

耐熱保護劑配方與冷凍干燥工藝相互配套，保護劑是凍干工藝的基礎，合理的保護劑配方和適宜的凍干曲線是制品順利凍干的保證。在保證質量的前提下需要減少能耗、降低成本。凍干工藝主要分為預凍階段和干燥階段，在不同階段需要通過參考制品的熱參數(shù)，如共晶點、塌陷溫度等進行設計。其中，塌陷溫度是在真空冷凍的過程中測得的，能夠真實反映制品的特性[11]。當溫度超過塌陷溫度會造成制品底部熔融、塌陷、萎縮，損害干燥制品的多孔結構，增加殘余水分，降低生物制品的效價[12]。因此，以塌陷溫度作為臨界溫度，可以提高升華干燥速度，縮短凍干時間。

本研究針對豬瘟凍干工藝周期長、耗能高及豬瘟耐熱保護劑配方通用性等問題，以呂芳等的無明膠、無蛋白的豬瘟耐熱保護劑配方[8]為基礎，添加甘露醇、甘氨酸等成分，通過間接免疫熒光法篩選耐熱保護組方。將篩選的配方分別和豬睪丸、牛睪丸細胞凍干，初步對配方的通用性進行探索。并根據(jù)共晶點和塌陷溫度科學設計凍干程序，獲得耗能低、凍干周期短的凍干曲線，研制安全、耐熱、節(jié)能的豬瘟減毒凍干疫苗凍，為豬瘟耐熱保護劑配方在實際生產(chǎn)上的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬瘟兔化弱毒株（豬睪丸原代細胞毒）和ST細胞，均由成都天邦生物制品有限公司提供;豬瘟兔化弱毒株（牛睪丸原代細胞毒），由南京天邦生物制品有限公司提供;甘露醇、甘氨酸等，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;DMEM培養(yǎng)基、谷氨酸鈉等其他試劑耗材，均購自Sigma公司;鱟試劑盒、細菌內(nèi)毒素標準品（0.25 EU/mL）和檢查用水，均購自湛江安度斯生物有限公司。

1.2 試驗儀器

凍干機（美國Virtis，Advantage Plus型號）;37 ℃ 和45 ℃恒溫干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;熒光顯微鏡（德國蔡司）、磁力攪拌器（金壇榮華儀器制造有限公司）、低溫凍干顯微鏡（英國林肯，型號FDCS196）、DSC熱分析儀（美國PerkinElmer公司）。

1.3 豬瘟耐熱保護劑活疫苗配制

以無明膠、無蛋白的豬瘟耐熱保護劑配方A為基礎[8]，添加甘露醇、甘氨酸等成分，設計出組方 A（1）～A（6）。配制時，根據(jù)配方成分的性質將其分為A、B部分制備，其中A為不耐熱成分，超純水溶解后用0.22 μm的濾膜過濾除菌;B為耐熱成分，采用高溫高壓法滅菌。耐熱保護劑配方與CSFV病毒液等比例混合，進行冷凍干燥，凍干程序參照文獻[8]。

1.4 加速熱穩(wěn)定性試驗

將不同配方配制的豬瘟耐熱凍干活苗置于 37 ℃ 保存10 d，每組取5瓶樣品進行加速耐老化試驗。根據(jù)參考文獻[13-14]，通過間接免疫熒光法檢測豬瘟TCID50，比較不同保護劑配方對豬瘟的耐熱效果。為比較耐熱保護劑配方對不同細胞下擴繁的豬瘟病毒的通用性，采用牛睪丸原代細胞培養(yǎng)的豬瘟兔化弱毒C株與篩選出來的耐熱保護劑配方進行凍干，37 ℃保存10 d，采用《中國獸藥典（2015年版）》兔體感染量（rabbit infection dose，RID）方法進行復核[15]。

1.5 耐熱保護劑配方熱參數(shù)的測定

將篩選的豬瘟耐熱保護劑與豬瘟病毒等比例混合，測定混合液的共晶點和塌陷溫度。共晶點采用DSC熱分析儀測定，檢測條件為：對液體狀態(tài)疫苗以10 ℃/min升溫速率，從-50 ℃升至30 ℃，通過記錄熱焓變化曲線，分析得到共晶點溫度。

塌陷溫度采用低溫凍干顯微鏡測定，檢測指標為：起始溫度-45 ℃，真空為20.0 Pa，升溫速率 2 ℃/s，最終溫度20 ℃;由上海東富龍科技股份有限公司進行檢測。

1.6 疫苗預凍方式的篩選

預凍環(huán)節(jié)是冷凍干燥的起始環(huán)節(jié)，也是凍干技術的基礎，不同類型的藥品成分其理化性質存在差異，在預凍方式上也存在差異[16]。根據(jù)“1.5”節(jié)方法測定的熱參數(shù)指標，確定預凍溫度和主干燥溫度，并設計快速冷凍、慢速冷凍和退火3種方式對豬瘟耐熱疫苗進行凍干。凍干樣品采用“1.4”節(jié)方法進行加速耐老化試驗，根據(jù)《中國藥典》第3部通則0832檢測殘水分，殘水率應不高于3%[17]。

1.7 疫苗凍干時長的優(yōu)化

在保證豬瘟疫苗耐熱性能的前提下，降低制品凍干過程的能耗，節(jié)約成本是冷凍干燥工藝研究生產(chǎn)中必須考慮的因素。物料的性質是影響凍干效率和時長的關鍵因素。需要提高一次干燥階段疫苗的干燥速率，縮短凍干時長。根據(jù)“1.5節(jié)”檢測的塌陷溫度和“1.6”節(jié)篩選預凍方式，對凍干時長進一步優(yōu)化，將縮短凍干程序至24 h。凍干樣品采用“1.4”節(jié)方法進行加速耐老化試驗。

1.8 豬瘟耐熱活疫苗耐熱性能檢測

根據(jù)篩選出的豬瘟耐熱保護劑配方和凍干程序，重新制備3批次豬瘟耐熱凍干活苗，置于 37 ℃ 和45 ℃保存，在不同時間點取出，檢測豬瘟耐熱疫苗效價，以保存期內(nèi)病毒滴度下降1.0 lg為判定終點。

1.9 內(nèi)毒素含量檢測

豬瘟耐熱活疫苗中內(nèi)毒素含量過高是引起動物產(chǎn)生過敏反應的主要原因之一，為檢測豬瘟耐熱配方和豬瘟耐熱活疫苗的內(nèi)毒素限制，試驗參考《中國獸藥典（2015年版）》[15]中的鱟試劑方法進行檢測，根據(jù)參考文獻[18]，用內(nèi)毒素標準用水分別將耐熱保護劑和豬瘟耐熱活苗稀釋10、50、100倍，用標示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑進行比較。

1.10 豬瘟耐熱活疫苗安全性能檢測

參照《中國獸藥典（2015年版）》對疫苗進行安全檢驗[15]。選用30日齡三元仔豬，將篩選的豬瘟耐熱凍干活疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成1 mL含20頭份和30頭份，1 mL/頭，每個劑量組肌肉注射豬10頭，對照組不免疫。接種后隔離觀察，主要觀察接種后仔豬的精神、采食、排泄等臨床情況，按質量標準判定疫苗合格情況。

1.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析處理，以x[TX-*5]±s表示，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 耐熱保護劑的初步篩選

將耐熱保護劑配方A（1）～A（6）分別與豬瘟病毒混合后凍干，于37 ℃放置10 d進行加速耐老化試驗。由表1可知，與基礎配方A進行對比，在凍干損失方面，配方A（4）的凍干損失最小，僅為 0.3 lg，顯著低于其他試驗配方（P<0.05）。在耐熱損失方面，配方A（4）的耐熱損失為0.45 lg，顯著低于基礎配方A（P<0.05）。綜合凍干損失和耐熱損失2個指標，配方A（4）的凍干耐熱保護效果最好。將A和A（4）配方分別與牛睪丸原代細胞擴繁的CSFV凍干，通過兔體熱試驗檢測耐熱效果，結果發(fā)現(xiàn)，A（4）配方的耐熱損失為0.44 lg，顯著優(yōu)于基礎配方A（P<0.05）。A（4）配方對不同細胞培養(yǎng)的CSFV均具有耐熱效果。

2.2 熱參數(shù)

根據(jù)篩選出來的豬瘟耐熱保護劑配方A（4）與豬瘟混合，進行熱參數(shù)的測定。由表2可知，混合液的共晶點為-27.51 ℃，塌陷溫度為-24.30 ℃。根據(jù)共晶點參數(shù)，將預凍的溫度設置為-42.00 ℃，保證樣品在該階段充分凍實。在主干燥階段，由于隔板溫度比樣品溫度高10 ℃左右[19]， 為防止樣品發(fā)生熔融、塌陷、萎縮，要將制品溫度控制在塌陷溫度以下。

2.3 疫苗凍干程序篩選

參考“2.2”節(jié)熱參數(shù)性能指標，設定預凍溫度為-42.00 ℃，主干燥溫度為-15.00 ℃。在凍干過程中，預凍程序是影響凍干效率的關鍵步驟，物料不同，預凍的速率也存在差異，降溫速度影響凍結快慢從而影響冰晶顆粒的大小和凍干時間。為篩選合適的預凍程序，分別采用快凍（圖1-程序1），慢凍（圖1-程序2）和退火（圖1-程序3）對A（4）配制的豬瘟耐熱疫苗進行凍干，凍干時長在32～35 h。

將3種程序凍干的疫苗在37 ℃放置10 d，進行加速熱穩(wěn)定試驗。由表3可知，快凍和退火程序下豬瘟苗的凍干損失約0.2 lg，凍干效果顯著優(yōu)于慢凍程序（P<0.05）。由表3可知，快凍程序下的耐熱損失為0.38 lg，極顯著低于慢凍和退火程序（P<0.01）。在快凍程序下，豬瘟苗的凍干損失和耐熱損失最小。因此，選擇快凍方式作為豬瘟耐熱配方A（4）的預凍方式，對凍干程序繼續(xù)進行優(yōu)化。

2.4 凍干時長縮短

作為冷凍干燥工藝研究的重要任務之一，需要對凍干時長進行縮短、降低能耗，以節(jié)約成本。根據(jù)制品的塌陷溫度，程序4（圖2-A）以程序1（圖1-程序1）為基礎，提高主干燥溫度，將凍干時長縮短至24 h。在程序4中將主干燥溫度提高，縮短主干燥時長，觀察程序4的制品凍干實時曲線，發(fā)現(xiàn)在主干燥階段，制品的溫度仍維持在塌陷溫度以下;在20 ℃左右，制品線與隔板重合，制品干燥完全，殘水率檢測合格。程序4在保證凍形同時提高縮干燥效率，縮短凍干時長（圖2）。對程序4凍干的疫苗檢測凍干損失和耐熱損失，與原凍干程序2無明顯差異（P>0.05），凍干損失在0.5 lg，耐熱損失在 0.3 lg（表4）。

2.5 豬瘟凍干疫苗的耐熱性能

將3批次豬瘟耐熱凍干疫苗分別放置于37 ℃和45 ℃保存，在指定時間點取出，檢測樣品的耐熱性能。圖3-A顯示，凍干苗在37 ℃放置15 d時耐熱損失在0.8 lg左右;20 d時耐熱損失在1.1 lg左右。圖3-B顯示，凍干苗在45 ℃保存7 d，耐熱損失在1.0 lg左右。

2.6 豬瘟耐熱保護劑活疫苗內(nèi)毒素含量

內(nèi)毒素是引起仔豬發(fā)生過敏反應的原因之一，本研究將內(nèi)毒素含量作為判斷配方副作用的指標。對耐熱保護劑和耐熱保護劑活疫苗進行10、50、100倍稀釋后，在陰性和陽性對照組成立的條件下，各稀釋倍數(shù)下的樣品組均對靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑無干擾（表5），說明其內(nèi)毒素含量低于1 EU/mL，耐熱保護劑和耐熱保護劑活疫苗是安全的。

2.7 豬瘟耐熱凍干疫苗的安全性

將篩選的豬瘟凍干活苗復溶，頸部肌肉注射，觀察仔豬的采食、體溫、精神狀態(tài)等，發(fā)現(xiàn)所有仔豬均無不良反應，體溫及精神狀態(tài)正常，根據(jù)獸用生物制品質量標準判定疫苗對豬體是安全，篩選的配方無不良反應。

3 討論

選用合適的保護劑對疫苗的質量和長期保存的穩(wěn)定性至關重要。市場上現(xiàn)有的豬瘟活疫苗通常會添加蔗糖、脫脂奶粉和明膠等保護劑，組方簡單、保護功能差，脫脂奶粉和明膠作為外源性蛋白容易引起豬，尤其是仔豬的過敏反應[20]。試驗前期，呂芳等成功篩選出無明膠、無蛋白的耐熱保護配方能夠使豬瘟疫苗在37 ℃保存15 d，且安全無副反應，但是凍干耗時長在40～42 h[9]。本試驗在該配方基礎上進一步優(yōu)化，縮短凍干時長，提高干燥效率[8]。

在對疫苗進行冷凍干燥處理時，起始環(huán)節(jié)是預凍階段，在該階段要保證制品充分凍實，制品溫度要低于共晶點溫度10 ℃左右。不同類型的藥品成分理化性質不同，對預凍階段程序的設定也存在差異。預凍速率是影響冰晶大小、獸用疫苗存活率和升華速率的關鍵因素[21]。根據(jù)預凍速率將其分為快凍、慢凍和退火。本次試驗對預凍程序進行篩選優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)在快凍程序下豬瘟的凍干和耐熱損傷最小。這可能是降溫速率影響冰晶成核大小，快凍形成的冰晶顆粒更小，對病毒造成的機械損傷較輕[22]。

在冷凍過程中，一次干燥是整個凍干工藝中耗時最長的階段，一次干燥周期與制品的塌陷溫度有關。塌陷溫度是指制品干燥過程中失去剛性，開始變黏，發(fā)生類似塌方的崩解、融化或產(chǎn)生發(fā)泡現(xiàn)象的臨界溫度，在凍干過程發(fā)生塌陷會嚴重影響凍干制品品質，因此制品在一次干燥的溫度必須要低于塌陷溫度。塌陷溫度取決于制品本身的性質和保護劑的種類。制品的塌陷溫度提高，有利于提高主干燥溫度，提高干燥效率，節(jié)省凍干能耗和時長[23]。氨基酸是常用的蛋白保護劑之一，有研究指出，甘氨酸能提高生物制品的可塑性，提高制品的塌陷溫度[24]。此外，甘露醇是常用的賦形劑，楊智等發(fā)現(xiàn)2%甘露醇在升華過程中未發(fā)生崩解，能夠提高配方的塌陷溫度[11]。本次試驗通過添加甘露醇、甘氨酸等成分，將制品塌陷溫度從-31 ℃提高至 -24 ℃?；谥破匪轀囟鹊奶岣?，在一次干燥階段，提高板層設置溫度，提高干燥效率，將凍干時長縮短至 24 h，殘水率合格，豬瘟耐熱疫苗凍干損失0.5 lg，耐熱損失0.3 lg，極大地減少了凍干能耗、時長，降低了經(jīng)濟成本。在耐熱性能方面，研究報道的豬瘟活苗37 ℃能保存7～10 d[25]，本研究中豬瘟活苗在37 ℃可保存15 d左右，在45 ℃可保存7 d左右。內(nèi)毒素和動物試驗均顯示該配方是安全、無副反應的，本研究成功篩選出耐熱性能好、無副作用、低耗能的豬瘟耐熱保護劑配方，成功將凍干時長縮短至 24 h，初步探索了配方對不同細胞擴繁的豬瘟病毒的通用性，可為豬瘟耐熱凍干保護劑配方在實際生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1]夏銘崎. 豬瘟國內(nèi)外流行新趨勢[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2017（3）：41-44.

[2]王元元. 規(guī)?；B(yǎng)豬場豬瘟流行特征、原因分析及疫苗研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2018（5）：165.

[3]Chenut G，Saintilan A F，Burger C，et al. Oral immunisation of swine with a classical swine fever vaccine（Chinese strain）and transmission studies in rabbits and sheep[J]. Veterinary Microbiology，1999，64（4）：265-276.

[4]Kartoglu U，Milstien J. Tools and approaches to ensure quality of vaccines throughout the cold chain[J]. Expert Review of Vaccines，2014，13（7）：843-854.

[5]管清江，鄒桂榮. 改進藍耳病疫苗凍干工藝提高產(chǎn)品質量的工藝探索[J]. 中國農(nóng)資，2013（28）：139.

[6]Evans R K，Nawrocki D K，Isopi L A，et al. Development of stable liquid formulations for adenovirus-based vaccines[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2004，93（10）：2458-2475.

[7]Stewart M，Ward S J，Drew J. Use of adenovirus as a model system to illustrate a simple method using standard equipment and inexpensive excipients to remove live virus dependence on the cold-chain[J]. Vaccine，2014，32（24）：2931-2938.

[8]Wiggan O，Livengood J A，Silengo S J，et al. Novel formulations enhance the thermal stability of live-attenuated flavivirus vaccines[J]. Vaccine，2011，29（43）：7456-7462.

[9]呂 芳，趙艷紅，張小飛，等. 豬瘟無明膠無蛋白耐熱活疫苗的研制及凍干工藝[J]. 中國獸醫(yī)學報，2016，36（12）：2014-2018.

[10]鄒立宏，何平有，翟含流. 豬瘟耐熱保護劑活疫苗生產(chǎn)工藝研究[J]. 獸醫(yī)導刊，2018，293（7）：71-72.

[11]楊 智，李代禧，張 燕，等. 冷凍干燥過程中重要參數(shù)塌陷溫度的研究[J]. 應用化工，2014（5）：962-965.[HJ2.05mm]

[12]馬兆堂，丁 敏. 淺談藥物凍干曲線的制定及常見問題分析[J]. 當代化工研究，2017（4）：146-147.

[13]李晶梅，朱 薇，秦紅剛，等. IFA和IPMA方法測定豬瘟兔化弱毒病毒含量[J]. 中國獸藥雜志，2013，47（10）：35-38.

[14]王遵寶，李俊輝，張先鋒，等. 利用熒光定量RT-PCR法與間接免疫熒光法比較測定豬瘟兔化弱毒病毒含量[J]. 中國獸醫(yī)學報，2017，37（3）：410-414.

[15]中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典：3部[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[16]賈立峰. 冷凍技術在制藥工藝中的應用[J]. 中國新技術新產(chǎn)品，2018（8）：37-38.

[17]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2009.

[18]郭廣君，呂素芳，苗立中，等. 豬瘟脾淋毒耐熱保護劑活疫苗內(nèi)毒素檢測方法的建立與應用[J]. 中國動物檢疫，2010，27（2）：35-37.

[19]滕有壽，姜海艷. 制訂生物制品凍干曲線的探討[J]. 中國獸藥雜志，2009，43（11）：53-55.

[20]譚長江，孟宇航. 獸用疫苗耐熱凍干保護劑的研究進展[J]. 中國畜禽種業(yè)，2011，7（6）：16-18.

[21]Nakagawa K，Murakami W，Andrieu J，et al. Freezing step controls the mannitol phase composition heterogeneity[J]. Chemical Engineering Research & Design，2009，87（8）：1017-1027.

[22]錢應璞. 制劑藥品的凍結真空干燥技術[J]. 機電信息，2004（15）：3-11.

[23]徐成海，張志軍，張 斌. 凍干技術的幾個熱點問題[J]. 干燥技術與設備，2010（5）：205-210.

[24]Flood A，Estrada M，McAdams D，et al. Development of a freeze-dried，heat-stable influenza subunit vaccine formulation[J]. PLoS One，2016，11（11）：e0164692.

[25]汪宏才，楊 峻，楊 濤，等. 豬瘟活疫苗耐熱保護劑研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（11）：2795-2797.

收 稿日期：2019-05-06

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFD0500706-2）;江蘇省農(nóng)業(yè)科學院探索性顛覆性創(chuàng)新計劃[編號：ZX（17）2016]。

作者簡介：左曉昕（1992—），女，江蘇泰州人，碩士，從事獸用疫苗耐熱劑型研究。E-mail：zuoxiaoxin08@163.com。

通信作者：呂 芳，碩士，副研究員，從事獸用疫苗耐熱劑型研究。E-mail：lvfang31@163.com。