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        響應(yīng)面法優(yōu)化野生白靈菇菌絲生長條件

        2020-05-11 12:30:11許俊齊賈君徐超凡軍民謝春芹曹淼魏壯壯
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:白靈菇碳氮比響應(yīng)面法

        許俊齊 賈君 徐超 凡軍民 謝春芹 曹淼 魏壯壯

        摘要: 以新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣野生白靈菇為研究對象,探討其菌絲培養(yǎng)階段pH值、溫度、碳源、氮源、碳氮比(C/N)對野生白靈菇菌絲生長特性的影響。結(jié)果表明,pH值為6.5~7.5條件下,白靈菇菌絲生長速度保持在相對較高水平,培養(yǎng)溫度為24~26 ℃較利于白靈菇菌絲的生長;白靈菇菌絲培養(yǎng)良好的碳源為蔗糖、麥芽糖,氮源為蛋白胨、酵母浸膏;培養(yǎng)基中,C/N為20 ∶1時,菌絲生長速度相對最快。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)對白靈菇菌絲生長條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,菌絲生長較優(yōu)的條件為溫度24 ℃、pH值6.5、碳氮比21? ∶ 1,此條件下白靈菇菌落直徑為58.13 mm,菌絲生長速度為4.79 mm/d,與預(yù)測值相符。

        關(guān)鍵詞: 白靈菇;菌絲特性;溫度;碳氮比;pH值;響應(yīng)面法

        中圖分類號: S646.1+40.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2020)05-0137-06

        白靈菇(Pleurotus nebrodensis)別稱天山白靈芝,擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬(Pleurotus)真菌[1],子實(shí)體通體潔白,菇體肥大,蓋厚柄粗,脆嫩可口,質(zhì)地密實(shí),香味濃郁,具有藥用和保健功能。白靈菇營養(yǎng)豐富,人體必需的8種氨基酸含量相對較高,占其總氨基酸含量的35%,對提高人體非特異性免疫功能具有良好的促進(jìn)作用,是一種珍稀的天然保健食品[2-7],存在較好的市場潛力和經(jīng)濟(jì)效益。

        白靈菇在我國僅分布于新疆維吾爾自治區(qū)的干旱沙漠地區(qū),故又有“天山神菇”“西天白靈菇”之稱[8-9],其中,新疆塔城縣白靈菇具有朵型大、顏色潔白、產(chǎn)量高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)以新疆塔城縣白靈菇菌種為對象,探討其菌絲培養(yǎng)條件及生長特性,以選育出適合江蘇地區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的菌株,增加江蘇白靈菇品類,并改進(jìn)其現(xiàn)有栽培技術(shù),為新疆白靈菇的成功引種奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試菌種 白靈菇菌種,由新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇種植基地提供。

        1.1.2 儀器與設(shè)備 JA2003型電子天平,上海天平儀器廠生產(chǎn);美的(Midea)WK2102型電磁爐,美的集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);SW-CJ-LF型凈化操作臺,圣欣科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);LRH-150B型恒溫培養(yǎng)箱,天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn);XFS-280A型高壓滅菌鍋,上海尚道儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

        1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨2.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g,瓊脂粉12.0 g,蒸餾水1 000 mL,自然pH值。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 不同培養(yǎng)條件對白靈菇菌絲生長的影響 將菌齡與厚度基本一致、顏色潔白、直徑為5 mm的白靈菇菌種圓片,分別接種到1個條件或物質(zhì)發(fā)生變化、其他條件或物質(zhì)相對固定不變的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,相對濕度為75%~80%、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng);待菌絲萌發(fā),采用“十”字交叉法測定菌落直徑,每隔12 h測量1次,連續(xù)測量5 d,測量10次,計(jì)算菌絲日均生長速率及菌絲長勢。試驗(yàn)設(shè)置不同pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5;設(shè)置光照培養(yǎng)箱不同溫度為20、22、24、26、28 ℃;設(shè)置不同碳源為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖;設(shè)置不同氮源為硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨;固定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖含量不變,變換蛋白胨含量,設(shè)置不同碳氮比(C/N)為10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1。每處理重復(fù)3次。

        1.2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,分別以菌絲生長速度平均值、菌絲培養(yǎng)5 d時的菌落直徑為響應(yīng)值,采用響應(yīng)曲面分析法對白靈菇菌絲生長溫度、pH值、C/N這3個條件進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析

        采用Minitab數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、WPS 2016軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,利用Design-expert 8.0.6軟件對響應(yīng)曲面法獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和回歸分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同培養(yǎng)條件對白靈菇菌絲生長的影響

        2.1.1 pH 值 由圖1可知,白靈菇菌絲在pH值為4.5~8.5的培養(yǎng)基上均能生長,且菌絲生長速度在不同pH值條件下相互間差異不顯著(P>0.05);隨培養(yǎng)時間的延長,白靈菇菌絲生長速度整體呈先增加后降低趨勢,培養(yǎng)3 d時菌絲日生長速度相對最高,這可能與培養(yǎng)基中菌絲營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸消耗有關(guān);pH值為8.5的較高pH值條件及pH值為4.5、5.5的較低pH值條件下,菌絲日生長速度相對較低,而pH值為6.5、7.5條件下,菌絲日生長速度保持在4.23 mm/d以上,且菌絲潔白、濃密。因此,白靈菇菌絲生長培養(yǎng)基相對最適合的pH值為6.5~7.5。

        2.1.2 培養(yǎng)溫度 由表1可知,在不同培養(yǎng)溫度條件下,白靈菇菌絲生長速度存在明顯差異;隨培養(yǎng)溫度的增加,白靈菇菌絲日均生長速度呈先增加后下降趨勢,其中,24 ℃時菌絲生長速度達(dá)到最大,菌絲日均生長速度達(dá)到4.482 mm/d,與26、28 ℃培養(yǎng)的差異不顯著(P>0.05),極顯著高于22、20 ℃條件下培養(yǎng)的菌絲(P<0.01);24、26 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲潔白、濃密、粗壯,而28 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲日均生長速度較24、26 ℃的有所下降,菌絲色澤偏黃,且較為稀松,28 ℃的溫度條件已不適宜白靈菇菌絲生長。因此,白靈菇菌絲生長相對最適合的溫度為24~26 ℃。

        2.1.3 碳源 蔗糖、麥芽糖為雙糖,常在培養(yǎng)基中被用作小分子碳源。由表2可知,白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長,其中,以蔗糖、麥芽糖作為碳源相對較好,白靈菇菌絲日均生長速度相對較高,分別為4.504、4.450 mm/d,極顯著高于其他3種碳源(P<0.01);以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作為碳源培養(yǎng)白靈菇,其菌絲日均生長速度相互間存在顯著差異(P<0.05),其中以果糖作為碳源的菌絲生長速度相對最小。因此,蔗糖、麥芽糖作為碳源較適合白靈菇菌絲的生長,綜合考慮以蔗糖作為碳源白靈菇菌絲日均生長速度較為平穩(wěn),且價格低廉,較易獲得,故選擇蔗糖為白靈菇菌絲培養(yǎng)的較佳碳源。

        2.1.4 氮源 由表3可知,白靈菇菌絲培養(yǎng)可利用硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨作為氮源,但菌絲生長速度有明顯不同,其中,酵母浸膏、蛋白胨作為氮源的白靈菇菌絲日均生長速度相對較高,分別為4.192、4.014 mm/d,對菌絲生長的影響相互間差異不顯著(P>0.05),但極顯著高于其他2種氮源(P<0.01)。觀察菌絲外觀發(fā)現(xiàn),以硫酸銨、硝酸鉀為氮源的白靈菇菌絲較為稀松、顏色淺白,而以酵母浸膏、蛋白胨為氮源的白靈菇菌絲濃密,且菌落直徑明顯大于其他2組。因此,白靈菇菌絲生長的較佳氮源為酵母浸膏與蛋白胨。

        2.1.5 碳氮比 由表4可知,在不同碳氮比條件下,白靈菇菌絲都能生長,但菌絲生長速度有明顯不同;C/N為20 ∶ 1時,白靈菇菌絲日均生長速度為4.378 mm/d,顯著高于其他4個處理(P<0.05);C/N為25 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長速度與C/N為15 ∶ 1的處理相互間差異不顯著(P>0.05),C/N為10 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長速度與C/N為30 ∶ 1 的處理相互間差異不顯著。觀察菌絲外觀狀況發(fā)現(xiàn),C/N分別為20 ∶ 1、25 ∶ 1培養(yǎng)基培養(yǎng)的白靈菇菌絲濃密健壯,菌絲生長優(yōu)良??梢?,白靈菇為典型的木腐菌,在營養(yǎng)生長階段對碳源的需求相對較大,當(dāng)C/N為20 ∶ 1時利于白靈菇菌絲的生長。

        2.2 白靈菇菌絲生長條件的優(yōu)化

        2.2.1 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)多元回歸結(jié)果 采用Design Expert 8.0.6軟件對表5試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得出溫度(A)、pH值(B)、C/N(C)與菌絲生長速度(Y1)、菌落直徑(Y2)這2個響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系,而得到二次回歸方程(模型)分別為:

        Y1=4.78+0.10A+0.099B+0.066C-0.11AB+0.120AC+0.07BC-0.23A2-0.33B2-0.26C2;

        Y2= 57.28+3.43A+0.420B+3.330C-0.23AB-0.205AC-0.07BC-5.94A2-4.36B2-5.24C2。

        由表6可知,菌絲生長速度、菌落直徑模型P值均<0.0001,影響極顯著,失擬項(xiàng)P值分別為0.255 2、0.116 2,影響不顯著(P>0.05),說明試驗(yàn)?zāi)P徒⒑侠恚囼?yàn)設(shè)計(jì)可行,回歸方程能準(zhǔn)確反映溫度、pH值、C/N比對白靈菇菌絲生長速度、菌落直徑的影響;菌絲生長速度、菌落直徑模型決定系數(shù)R2分別為0.986 6、0.989 8,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj分別為0.969 4、0.968 0,說明模型擬合度較好,誤差較小,可用于白靈菇生長條件優(yōu)化試驗(yàn)的分析與預(yù)測;菌絲生長速度模型中,一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)A2、B2、C2對模型影響極顯著(P<0.01),一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB對模型影響顯著(P<0.05),交互項(xiàng)BC對模型影響不顯著(P>0.05),而白靈菇菌落直徑模型中,一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AC,二次項(xiàng)A2、B2、C2對模型影響極顯著,一次項(xiàng)B,交互項(xiàng)AB、BC對模型影響不顯著。

        2.2.2 因素間的交互作用 響應(yīng)面三維圖可反映各因素之間的交互作用,響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)值受到相應(yīng)因素變化的影響較為顯著。由圖2、圖3可知,溫度、pH值、C/N各兩因素對菌絲生長速度、菌落直徑響應(yīng)曲面較為陡峭,交互作用較為明顯,與回歸模型分析結(jié)果較為一致。

        2.2.3 菌絲生長條件優(yōu)化與驗(yàn)證 根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程,計(jì)算得到白靈菇菌落直徑相對最大的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.02、C/N 21.35 ∶ 1,此條件下菌落直徑預(yù)測值為58.152 9 mm;菌絲生長速度相對最優(yōu)的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.565、C/N 21.05 ∶ 1,此條件下菌絲生長速度預(yù)測值為4.805 57 mm/d。為便于實(shí)際生產(chǎn)操作,將優(yōu)化條件調(diào)整為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 1,此條件下測得的菌落直徑為58.13 mm,菌絲生長速度為 4.79 mm/d,與Design-Expert 8.0.6得出的最優(yōu)參數(shù)預(yù)測值較為吻合,可見該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法可靠有效。

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)結(jié)果表明,新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇菌絲在不同pH值培養(yǎng)基上均能生長,其中,在pH值為6.5的培養(yǎng)基上白靈菇菌絲生長發(fā)育良好;適宜白靈菇菌絲生長的相對最佳溫度為24~26 ℃,此條件下培養(yǎng)的白靈菇菌絲潔白、濃密、粗壯;白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長,其中以蔗糖作為碳源相對最好,白靈菇菌絲日均生長速度較為平穩(wěn),且蔗糖價格低廉,較易獲得;酵母浸膏是白靈菇菌絲生長相對較好的氮源,培養(yǎng)基中C/N為20 ∶ 1時更利于白靈菇菌絲的生長。

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,按照Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,分別以菌落直徑、菌絲生長速度為響應(yīng)值,以溫度、pH值、C/N為影響因子設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)曲面試驗(yàn),對白靈菇菌絲生長條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,得到的二次回歸模型相關(guān)性極顯著(P<0.01),準(zhǔn)確度、精密度較高,并得出白靈菇菌絲最優(yōu)生長參數(shù)為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 0,此條件下測得菌落直徑為58.13 mm,菌絲生長速度為4.79 mm/d。

        參考文獻(xiàn):

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        [9]呂作舟. 食用菌栽培學(xué)[M]. 北京:高等教育出版社,2006.

        收 稿日期:2019-01-24

        基金項(xiàng)目:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目——現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心平臺建設(shè)(編號:2014KJ26)。

        作者簡介:許俊齊(1986—),男,陜西西安人,碩士,實(shí)驗(yàn)師,從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏技術(shù)研究。E-mail:wozaijurong@163.com。

        通信作者:賈 君(1966—),博士,教授,從事食品質(zhì)量分析、農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量評價及加工研究。E-mail:772805883@qq.com。

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