許俊齊 賈君 徐超 凡軍民 謝春芹 曹淼 魏壯壯

摘要： 以新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣野生白靈菇為研究對象，探討其菌絲培養(yǎng)階段pH值、溫度、碳源、氮源、碳氮比（C/N）對野生白靈菇菌絲生長特性的影響。結果表明，pH值為6.5～7.5條件下，白靈菇菌絲生長速度保持在相對較高水平，培養(yǎng)溫度為24～26 ℃較利于白靈菇菌絲的生長;白靈菇菌絲培養(yǎng)良好的碳源為蔗糖、麥芽糖，氮源為蛋白胨、酵母浸膏;培養(yǎng)基中，C/N為20 ∶1時，菌絲生長速度相對最快。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理，設計3因素3水平響應面試驗對白靈菇菌絲生長條件進行優(yōu)化，結果表明，菌絲生長較優(yōu)的條件為溫度24 ℃、pH值6.5、碳氮比21? ∶ 1，此條件下白靈菇菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長速度為4.79 mm/d，與預測值相符。

關鍵詞： 白靈菇;菌絲特性;溫度;碳氮比;pH值;響應面法

中圖分類號： S646.1+40.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0137-06

白靈菇（Pleurotus nebrodensis）別稱天山白靈芝，擔子菌綱傘菌目側耳科側耳屬（Pleurotus）真菌[1]，子實體通體潔白，菇體肥大，蓋厚柄粗，脆嫩可口，質地密實，香味濃郁，具有藥用和保健功能。白靈菇營養(yǎng)豐富，人體必需的8種氨基酸含量相對較高，占其總氨基酸含量的35%，對提高人體非特異性免疫功能具有良好的促進作用，是一種珍稀的天然保健食品[2-7]，存在較好的市場潛力和經(jīng)濟效益。

白靈菇在我國僅分布于新疆維吾爾自治區(qū)的干旱沙漠地區(qū)，故又有“天山神菇”“西天白靈菇”之稱[8-9]，其中，新疆塔城縣白靈菇具有朵型大、顏色潔白、產量高等特點。本試驗以新疆塔城縣白靈菇菌種為對象，探討其菌絲培養(yǎng)條件及生長特性，以選育出適合江蘇地區(qū)產業(yè)發(fā)展的菌株，增加江蘇白靈菇品類，并改進其現(xiàn)有栽培技術，為新疆白靈菇的成功引種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 白靈菇菌種，由新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇種植基地提供。

1.1.2 儀器與設備 JA2003型電子天平，上海天平儀器廠生產;美的（Midea）WK2102型電磁爐，美的集團股份有限公司生產;HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產;SW-CJ-LF型凈化操作臺，圣欣科學儀器有限公司生產;LRH-150B型恒溫培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司生產;XFS-280A型高壓滅菌鍋，上海尚道儀器設備有限公司生產。

1.1.3 基礎培養(yǎng)基 蛋白胨2.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g，瓊脂粉12.0 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養(yǎng)條件對白靈菇菌絲生長的影響 將菌齡與厚度基本一致、顏色潔白、直徑為5 mm的白靈菇菌種圓片，分別接種到1個條件或物質發(fā)生變化、其他條件或物質相對固定不變的基礎培養(yǎng)基上，相對濕度為75%～80%、25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng);待菌絲萌發(fā)，采用“十”字交叉法測定菌落直徑，每隔12 h測量1次，連續(xù)測量5 d，測量10次，計算菌絲日均生長速率及菌絲長勢。試驗設置不同pH值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5;設置光照培養(yǎng)箱不同溫度為20、22、24、26、28 ℃;設置不同碳源為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖;設置不同氮源為硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨;固定基礎培養(yǎng)基中蔗糖含量不變，變換蛋白胨含量，設置不同碳氮比（C/N）為10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1。每處理重復3次。

1.2.2 響應曲面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，分別以菌絲生長速度平均值、菌絲培養(yǎng)5 d時的菌落直徑為響應值，采用響應曲面分析法對白靈菇菌絲生長溫度、pH值、C/N這3個條件進行3因素3水平Box-Behnken中心組合試驗。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Minitab數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、WPS 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用Duncans新復極差法進行差異顯著性分析，利用Design-expert 8.0.6軟件對響應曲面法獲得的試驗數(shù)據(jù)進行處理和回歸分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對白靈菇菌絲生長的影響

2.1.1 pH 值 由圖1可知，白靈菇菌絲在pH值為4.5～8.5的培養(yǎng)基上均能生長，且菌絲生長速度在不同pH值條件下相互間差異不顯著（P>0.05）;隨培養(yǎng)時間的延長，白靈菇菌絲生長速度整體呈先增加后降低趨勢，培養(yǎng)3 d時菌絲日生長速度相對最高，這可能與培養(yǎng)基中菌絲營養(yǎng)物質被逐漸消耗有關;pH值為8.5的較高pH值條件及pH值為4.5、5.5的較低pH值條件下，菌絲日生長速度相對較低，而pH值為6.5、7.5條件下，菌絲日生長速度保持在4.23 mm/d以上，且菌絲潔白、濃密。因此，白靈菇菌絲生長培養(yǎng)基相對最適合的pH值為6.5～7.5。

2.1.2 培養(yǎng)溫度 由表1可知，在不同培養(yǎng)溫度條件下，白靈菇菌絲生長速度存在明顯差異;隨培養(yǎng)溫度的增加，白靈菇菌絲日均生長速度呈先增加后下降趨勢，其中，24 ℃時菌絲生長速度達到最大，菌絲日均生長速度達到4.482 mm/d，與26、28 ℃培養(yǎng)的差異不顯著（P>0.05），極顯著高于22、20 ℃條件下培養(yǎng)的菌絲（P<0.01）;24、26 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲潔白、濃密、粗壯，而28 ℃條件下培養(yǎng)的白靈菇其菌絲日均生長速度較24、26 ℃的有所下降，菌絲色澤偏黃，且較為稀松，28 ℃的溫度條件已不適宜白靈菇菌絲生長。因此，白靈菇菌絲生長相對最適合的溫度為24～26 ℃。

2.1.3 碳源 蔗糖、麥芽糖為雙糖，常在培養(yǎng)基中被用作小分子碳源。由表2可知，白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，其中，以蔗糖、麥芽糖作為碳源相對較好，白靈菇菌絲日均生長速度相對較高，分別為4.504、4.450 mm/d，極顯著高于其他3種碳源（P<0.01）;以葡萄糖、可溶性淀粉、果糖作為碳源培養(yǎng)白靈菇，其菌絲日均生長速度相互間存在顯著差異（P<0.05），其中以果糖作為碳源的菌絲生長速度相對最小。因此，蔗糖、麥芽糖作為碳源較適合白靈菇菌絲的生長，綜合考慮以蔗糖作為碳源白靈菇菌絲日均生長速度較為平穩(wěn)，且價格低廉，較易獲得，故選擇蔗糖為白靈菇菌絲培養(yǎng)的較佳碳源。

2.1.4 氮源 由表3可知，白靈菇菌絲培養(yǎng)可利用硫酸銨、酵母浸膏、硝酸鉀、蛋白胨作為氮源，但菌絲生長速度有明顯不同，其中，酵母浸膏、蛋白胨作為氮源的白靈菇菌絲日均生長速度相對較高，分別為4.192、4.014 mm/d，對菌絲生長的影響相互間差異不顯著（P>0.05），但極顯著高于其他2種氮源（P<0.01）。觀察菌絲外觀發(fā)現(xiàn)，以硫酸銨、硝酸鉀為氮源的白靈菇菌絲較為稀松、顏色淺白，而以酵母浸膏、蛋白胨為氮源的白靈菇菌絲濃密，且菌落直徑明顯大于其他2組。因此，白靈菇菌絲生長的較佳氮源為酵母浸膏與蛋白胨。

2.1.5 碳氮比 由表4可知，在不同碳氮比條件下，白靈菇菌絲都能生長，但菌絲生長速度有明顯不同;C/N為20 ∶ 1時，白靈菇菌絲日均生長速度為4.378 mm/d，顯著高于其他4個處理（P<0.05）;C/N為25 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長速度與C/N為15 ∶ 1的處理相互間差異不顯著（P>0.05），C/N為10 ∶ 1的白靈菇菌絲日均生長速度與C/N為30 ∶ 1 的處理相互間差異不顯著。觀察菌絲外觀狀況發(fā)現(xiàn)，C/N分別為20 ∶ 1、25 ∶ 1培養(yǎng)基培養(yǎng)的白靈菇菌絲濃密健壯，菌絲生長優(yōu)良?？梢?，白靈菇為典型的木腐菌，在營養(yǎng)生長階段對碳源的需求相對較大，當C/N為20 ∶ 1時利于白靈菇菌絲的生長。

2.2 白靈菇菌絲生長條件的優(yōu)化

2.2.1 響應曲面設計多元回歸結果 采用Design Expert 8.0.6軟件對表5試驗結果進行多元回歸擬合，得出溫度（A）、pH值（B）、C/N（C）與菌絲生長速度（Y1）、菌落直徑（Y2）這2個響應值之間不是簡單的線性關系，而得到二次回歸方程（模型）分別為：

Y1=4.78+0.10A+0.099B+0.066C-0.11AB+0.120AC+0.07BC-0.23A2-0.33B2-0.26C2;

Y2= 57.28+3.43A+0.420B+3.330C-0.23AB-0.205AC-0.07BC-5.94A2-4.36B2-5.24C2。

由表6可知，菌絲生長速度、菌落直徑模型P值均<0.0001，影響極顯著，失擬項P值分別為0.255 2、0.116 2，影響不顯著（P>0.05），說明試驗模型建立合理，試驗設計可行，回歸方程能準確反映溫度、pH值、C/N比對白靈菇菌絲生長速度、菌落直徑的影響;菌絲生長速度、菌落直徑模型決定系數(shù)R2分別為0.986 6、0.989 8，調整決定系數(shù)R2Adj分別為0.969 4、0.968 0，說明模型擬合度較好，誤差較小，可用于白靈菇生長條件優(yōu)化試驗的分析與預測;菌絲生長速度模型中，一次項A、B、交互項AC、二次項A2、B2、C2對模型影響極顯著（P<0.01），一次項C、交互項AB對模型影響顯著（P<0.05），交互項BC對模型影響不顯著（P>0.05），而白靈菇菌落直徑模型中，一次項A、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2對模型影響極顯著，一次項B，交互項AB、BC對模型影響不顯著。

2.2.2 因素間的交互作用 響應面三維圖可反映各因素之間的交互作用，響應曲面坡度越陡峭，說明響應值受到相應因素變化的影響較為顯著。由圖2、圖3可知，溫度、pH值、C/N各兩因素對菌絲生長速度、菌落直徑響應曲面較為陡峭，交互作用較為明顯，與回歸模型分析結果較為一致。

2.2.3 菌絲生長條件優(yōu)化與驗證 根據(jù)二次多項式回歸方程，計算得到白靈菇菌落直徑相對最大的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.02、C/N 21.35 ∶ 1，此條件下菌落直徑預測值為58.152 9 mm;菌絲生長速度相對最優(yōu)的條件為溫度24.24 ℃、pH值6.565、C/N 21.05 ∶ 1，此條件下菌絲生長速度預測值為4.805 57 mm/d。為便于實際生產操作，將優(yōu)化條件調整為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 1，此條件下測得的菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長速度為 4.79 mm/d，與Design-Expert 8.0.6得出的最優(yōu)參數(shù)預測值較為吻合，可見該試驗設計方法可靠有效。

3 結論

本試驗結果表明，新疆維吾爾自治區(qū)塔城縣白靈菇菌絲在不同pH值培養(yǎng)基上均能生長，其中，在pH值為6.5的培養(yǎng)基上白靈菇菌絲生長發(fā)育良好;適宜白靈菇菌絲生長的相對最佳溫度為24～26 ℃，此條件下培養(yǎng)的白靈菇菌絲潔白、濃密、粗壯;白靈菇菌絲在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖這5種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，其中以蔗糖作為碳源相對最好，白靈菇菌絲日均生長速度較為平穩(wěn)，且蔗糖價格低廉，較易獲得;酵母浸膏是白靈菇菌絲生長相對較好的氮源，培養(yǎng)基中C/N為20 ∶ 1時更利于白靈菇菌絲的生長。

在單因素試驗的基礎上，按照Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，分別以菌落直徑、菌絲生長速度為響應值，以溫度、pH值、C/N為影響因子設計3因素3水平響應曲面試驗，對白靈菇菌絲生長條件進行優(yōu)化，結果表明，得到的二次回歸模型相關性極顯著（P<0.01），準確度、精密度較高，并得出白靈菇菌絲最優(yōu)生長參數(shù)為溫度24 ℃、pH值6.5、C/N 21 ∶ 0，此條件下測得菌落直徑為58.13 mm，菌絲生長速度為4.79 mm/d。

參考文獻：

[1]王蘭青，劉 宇，王守現(xiàn)，等. 工廠化栽培白靈菇配方篩選試驗[J]. 北方園藝，2012（1）：156-158.

[2]王耀榮，徐全飛，韓曉芳，等. 白靈菇工廠化栽培培養(yǎng)料篩選及栽培工藝的研究[J]. 天津農業(yè)科學，2011，17（3）：118-121.

[3]谷延澤. 白靈菇和杏鮑菇的營養(yǎng)分析與比較[J]. 安徽農業(yè)科學，2009，37（21）：9931-9932.

[4]Cui H Y，Wu S F，Sun Y P，et al. Polysaccharide from Pleurotus nebrodensis induces apoptosis via a mitochondrial path way in HepG2 cells[J]. Food & Function，2016，7：455-463.

[5]董洪新，劉新海，徐志玲，等. 白靈菇子實體多糖提取工藝的研究[J]. 食用菌學報，2004，11（1）：22-25.

[6]佘冬芳，樊衛(wèi)國，徐彥軍.白靈菇和大球蓋菇的營養(yǎng)分析與比較[J]. 食用菌，2007（4）：57-58.

[7]趙占軍，張 勇，李 毅，等. 白靈菇生理生化研究進展[J]. 山西農業(yè)科學，2012，40（3）：292-294.

[8]周長青. 白靈菇栽培基礎生理和關鍵技術研究[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2007.

[9]呂作舟. 食用菌栽培學[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

收 稿日期：2019-01-24

基金項目：江蘇農林職業(yè)技術學院科技項目——現(xiàn)代園藝工程技術中心平臺建設（編號：2014KJ26）。

作者簡介：許俊齊（1986—），男，陜西西安人，碩士，實驗師，從事農產品加工及貯藏技術研究。E-mail：wozaijurong@163.com。

通信作者：賈 君（1966—），博士，教授，從事食品質量分析、農畜產品質量評價及加工研究。E-mail：772805883@qq.com。