李 萍，周若瑜，闕月月，程 陽，何寶佳，章圣朋

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241002)

威靈仙來源于毛茛科植物臨床上常用于治療風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、骨鯁、筋脈拘攣以及屈伸不利等癥[1]。近年來研究顯示，威靈仙還在抗腫瘤以及降血壓、降血糖等方面發(fā)揮廣泛的治療與預(yù)防作用[2-3]。由于中藥成分復(fù)雜，很難明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法研究中藥作用機(jī)制，已成為中藥作用機(jī)制的探索和新藥研發(fā)的新手段[4-5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科理論，利益網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)行“疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從多維度多視角探索疾病與藥物之間的關(guān)聯(lián)，特別適用于中藥藥效機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究[6-8]。本研究以威靈仙為對象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，闡釋威靈仙抗結(jié)直腸癌藥效的作用機(jī)制，為其治療結(jié)直腸癌作用機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

利用計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，搜索威靈仙拼音weilingxian，選擇對應(yīng)拉丁名RadixClematidis，找到所含化學(xué)成分后，通過設(shè)定篩選條件口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%以及類藥性(drug-like，DL)≥0.18篩選出威靈仙的活性成分。使用pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找化合物結(jié)構(gòu)及分子式。

1.2 藥物和疾病靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP搜索威靈仙相關(guān)靶基因，使用篩選到的活性成分進(jìn)行過濾，去除重復(fù)基因后獲得威靈仙活性成分相關(guān)靶基因并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//sparql.uniprot.org/)獲得基因名。GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，以“Colorectal cancer”為檢索關(guān)鍵詞，收集與結(jié)直腸癌相關(guān)基因，將挖掘得到的結(jié)直腸癌相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)基因映射篩選出共同靶點(diǎn)，從而得到威靈仙抗結(jié)直腸癌的作用基因靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

將威靈仙的活性成分和結(jié)直腸癌交集靶點(diǎn)等相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.1軟件，構(gòu)建結(jié)直腸癌-威靈仙-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的獲得

將獲得的威靈仙和結(jié)直腸癌的蛋白靶點(diǎn)交集導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，限定物種為人，獲得取蛋白相互作用關(guān)系，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接數(shù)目繪制柱狀圖，獲得核心基因。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

找到基因?qū)?yīng)的ID，物種選擇人，Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http：//www.bioconductor.org/)獲取GO注釋信息，使用R包c(diǎn)lusterProfiler，進(jìn)行GO功能富集分析，選擇20個GO進(jìn)行可視化并生成柱狀圖，進(jìn)行KEGG分析生成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 威靈仙潛在活性化學(xué)成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索總共檢索到57種化合物。以O(shè)B≥30%、DL≥0.1作為化合物篩選條件。共篩選得到7個化合物作為潛在活性化合物(見表1)，占所有57種化合物的12.28%。7種潛在活性化合物中有4種無對應(yīng)靶基因，去除無對應(yīng)靶基因后獲得的活性化合物為β-谷固醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、鄰苯二甲酸二庚酯(Heptyl phthalate)，使用pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找相關(guān)的2D結(jié)構(gòu)式與分子式信息(見圖1)。

表1 威靈仙潛在活性化合物

圖1 三種活性化合物2D結(jié)構(gòu)式與分子式FIG.1 2D structural formulae and molecular formulae of the three active compounds

2.2 化合物基因取交集

圖2 結(jié)直腸癌-威靈仙靶點(diǎn)交集圖Fig.2 Network diagram of Radix climatidisand colorectal cancer

使用GenCards檢索結(jié)直腸癌相關(guān)基因，共收集到7469種基因。TCMSP搜索威靈仙對應(yīng)靶基因，共收集到310個基因，7種潛在活性化合物中有4種無對應(yīng)靶基因，收集的3種潛在活性化合物：β-谷固醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、鄰苯二甲酸二庚酯(Heptyl phthalate)篩選到的潛在威靈仙抗結(jié)直腸癌活性化合物對應(yīng)基因40種。對3種潛在活性化合物對應(yīng)的靶基因和結(jié)直腸癌對應(yīng)的靶基因取交集，獲得30種既與威靈仙潛在活性化合物相關(guān)又與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因(見圖1)。

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基因注釋后，運(yùn)用Cytoscape 3.1.1軟件構(gòu)建威靈仙活性疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示，紅色的代表疾病，藍(lán)色代表藥物，紫色代表潛在活性化合物，綠色代表靶點(diǎn)基因。

圖3 結(jié)直腸癌-威靈仙-威靈仙化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖疾病()藥物()化合物()靶基因()Fig.2 Target network diagram of compound of Radix climatidisdisease()drug()compounds()Target genes()

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及其核心靶點(diǎn)的篩選

為了進(jìn)一步了解威靈仙靶點(diǎn)和結(jié)直腸癌靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，本研究將篩選到的30個交集靶點(diǎn)基因粘貼到在線網(wǎng)站STRING(http：//string-db.org/

cgi/input.pl)，物種選擇人，并去除游離的靶蛋白，獲取蛋白相互作用的關(guān)系(見圖4)。在PPI網(wǎng)絡(luò)，靶點(diǎn)的連線越多則表示靶點(diǎn)越重要，通過計(jì)數(shù)每個靶點(diǎn)和其他靶點(diǎn)的連線數(shù)目，連線≥5條的基因有18種，其中Casp3和JUN的連線最多，達(dá)到了10條(見圖5)。

圖4 威靈仙與結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Core network(PPICN)diagram of Radix climatidis and colorectal cancer

圖5 威靈仙抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間連線數(shù)Fig.5 Core target of Radix Clematidis anti-colorectal cancer

2.5 GO富集分析結(jié)果

將威靈仙與結(jié)直腸癌交集靶基因進(jìn)行GO富集分析得到GO條目55個，根據(jù)P值選擇富集高的20個生成柱狀圖(見圖5)，圖中的GO注釋基本都與生物過程(biological process，BP)相關(guān)，如陰離子：陽離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)活動(anion：cationsymporter activity)、配體依賴的核受體結(jié)合(ligand-dependent nuclear receptor binding)、神經(jīng)遞質(zhì)：鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)活動(neurotransmitter：sodium symporter activity)、氯跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(chloride transmembrane transporter activity)等。

圖6 威靈仙治療結(jié)直腸癌關(guān)鍵靶蛋白的生物學(xué)功能注釋Fig.6 Annotation of biological function of Radix Clematidis anti-colorectal cancer key target protein

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

將威靈仙與結(jié)直腸癌交集靶基因進(jìn)行KEGG分析，關(guān)鍵靶基因富集在61條通路上。根據(jù)P值由小到大排序選擇前20條生成氣泡圖。圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；P值越小，圓點(diǎn)顏色越紅。主要通路包括復(fù)合型凋亡通路(Apoptosis-multiple species)、凋亡通路(Apoptosis)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、結(jié)直腸癌信號通路(Colorectal cancer)等相關(guān)通路(見圖7)。提示威靈仙可以通過以上多條通路作用于結(jié)直腸癌。

圖7 威靈仙治療結(jié)直腸癌KEGG通路富集分析Fig.7 Main KEGG pathways related to Radix Clematidis anti-colorectal cancer

3 討論

伴隨著環(huán)境變化、飲食結(jié)構(gòu)的改變和社會人口老齡化程度增加，直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢[9-11]，已居消化道惡性腫瘤的第2位[12]。直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，臨床預(yù)后普遍較差，已成為中老年人死亡的主要病因之一[13]。目前治療結(jié)直腸癌的核心手段仍然是手術(shù)切除，但存在費(fèi)用高、禁忌證多等問題[14]。中藥可有效改善結(jié)直腸癌進(jìn)程，存在著廣闊的應(yīng)用前景[15]。威靈仙是臨床上的常用藥物，《抗癌治驗(yàn)本草》言其能敗毒抗癌?，F(xiàn)代藥理研究也證明，威靈仙可抑制消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞增殖，從東北鐵線蓮分離的三萜皂苷mandshunosides A-B以及mandshunosides C-E可抑制2種結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116和HT-29活性[16-17]，但因該數(shù)據(jù)未被TCMSP收錄，可能結(jié)果尚存在爭議，因此未納入分析。

通過構(gòu)建“結(jié)直腸癌-威靈仙-威靈仙化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”，以及生物信息挖掘，分析了威靈仙抗結(jié)直腸癌的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制，結(jié)果顯示威靈仙中甾醇類(豆甾醇、β-谷固醇)及鄰苯二甲酸酯類(鄰苯二甲酸二庚酯)等化合物顯示出了潛在的抗結(jié)直腸癌活性。前期研究發(fā)現(xiàn)這豆甾醇、β-谷固醇確實(shí)具有較好的抗腫瘤作用[18，19]，鄰苯二甲酸二庚酯雖未有報(bào)道但本研究顯示其很大可能是潛在的抗腫瘤物質(zhì)。CASP3、JUN、ADRA1B、MAOA等是威靈仙抗結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中大部分成分都直接作用在CASP3、JUN 2個靶點(diǎn)上而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。CASP3是細(xì)胞外源性死亡受體凋亡通路關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，大量的研究證實(shí)CASP3是一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路，其活化最終引起細(xì)胞凋亡[20]。凋亡的調(diào)控基因很重要的家族是CASP3超家族，CASP3在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[21-23]。JUN蛋白家族以二聚體形式結(jié)合形成激活子蛋白-1(activator protion，AP-1)。JUN作為AP-1的主要組成成分，通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。有研究顯示在結(jié)直腸癌組織樣本中JUN蛋白在其細(xì)胞胞漿和細(xì)胞胞核的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增高[24-25]。c-Jun基因的顯性失活突變體(TAM67)可以通過抑制內(nèi)源性AP-1的活性導(dǎo)致細(xì)胞G1間期停滯。將攜帶此突變體的結(jié)直腸癌細(xì)胞移植入裸鼠可顯著減小裸鼠荷瘤體積[26]。這些研究均表明JUN蛋白在結(jié)直腸腫瘤形成過程中扮演了重要角色。

本研究對威靈仙抗結(jié)直腸癌的潛在通路進(jìn)行了KEGG通路分析，篩選出的相關(guān)度最高的20條相關(guān)通路中Apoptosis信號通路和p53信號通路尤為引入注目。Apoptosis信號通路包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。在外源性途徑中，TRAIL與DR5或DR4結(jié)合導(dǎo)致受體三聚化，誘導(dǎo)procaspase-8自裂解，釋放caspase-8，激活下游的caspase-3、caspase-6和caspase-7，最終使細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑又被稱為線粒體凋亡途徑，細(xì)胞膜電位的改變促使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，繼而與凋亡相關(guān)因子-1(apaf-1)結(jié)合，形成多聚體，并促使procaspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體。procaspase-9活化，導(dǎo)致caspase-3的活化最終引起凋亡[22]。p53信號通路參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在致癌化合物、輻射等致病因素刺激下，經(jīng)過一系列的磷酸化和翻譯后修飾，p53被激活，參與細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)和細(xì)胞周期阻滯的p53靶基因表達(dá)[28]。p53能夠通過促進(jìn)DNA修復(fù)，推進(jìn)細(xì)胞程序死亡，從而阻止癌癥的發(fā)生進(jìn)展[29]。中藥中的一些成分如大黃素可通過誘導(dǎo)ROS，觸發(fā)p53介導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡途徑[30]，而在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8中，抑制p53的表達(dá)最終可導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展[31]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析后，篩選出了威靈仙抗結(jié)直腸癌可能的潛在化合物和靶點(diǎn)，這些潛在化合物可能是通過Apoptosis、p53信號通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡而發(fā)揮作用。