茆 武 熊竹友 李 薇 李光早

蚌埠醫(yī)學(xué)院；①蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 安徽蚌埠 233030

唇裂伴或不伴腭裂是最常見的先天性畸形之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在大多數(shù)唇腭裂當(dāng)中，不包括其他系統(tǒng)畸形的非綜合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)最為普遍。NSCL/P的致病因素主要包括環(huán)境因素和遺傳因素，已發(fā)現(xiàn)IRF6、TGFα、TGFb3、MSX1和CRISPLD2等基因與NSCL/P的發(fā)生相關(guān)。就發(fā)病率來說，亞洲人患病率最高，其次歐洲人，非洲人最低[1]。綜合征性唇腭裂(Syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P)的病因較為明確,比如最為典型的Van der woude綜合征主要是由GRHL3基因和IRF6基因突變引起的[2,3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)位于第一號染色體1p36.3位置，全長20.374 kb，共有外顯子12個(gè));其mRNA全長7150 bp，編碼656個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，能催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)換成5-甲基四氫葉酸鹽，使之能為同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸[4]。甲硫氨酸是人體葉酸代謝中的一種重要的酶。研究顯示葉酸可預(yù)防神經(jīng)管缺陷，減少新生兒頜面部裂隙的發(fā)生[5]。MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的突變會引起MTHFR活性下降，從而影響DNA甲基化過程，是近年來國內(nèi)外比較關(guān)注的NSCL/P可能致病因素之一[6,7]。本研究對皖北地區(qū)人群MTHFR基因A1298C的多態(tài)性及孕婦葉酸攝入情況進(jìn)行調(diào)查,并分析其與NSCL/P的相關(guān)性，為NSCL/P防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2018年1月～2019年5月于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科及口腔頜面外科就診的100例NSCL/P患兒，其中男59例，女41例；年齡3個(gè)月～20歲，平均4歲。均經(jīng)兩位副高以上職稱醫(yī)生排除其他先天性疾病及其他包含頜面部發(fā)育畸形的綜合征類疾病，包括范德伍德綜合征、先天性心臟病伴唇腭裂、歌舞妓面綜合征等。選擇同期在本院兒科因呼吸道感染住院的患兒120例為對照組，無先天性畸形，家族中無唇腭裂患者。所有參與者或其監(jiān)護(hù)人在參加本研究前均已簽署知情同意書，研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2樣本采集方法 采集NSCL/P患兒空腹肘靜脈血2mL，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后-80℃低溫保存。對照組通過艾德萊(DN-39)唾液收集器收集唾液2mL,4℃低溫保存。對所有研究對象通過調(diào)查問卷方式調(diào)查母親妊娠前3個(gè)月的葉酸補(bǔ)充情況，其自定義變量為孕前3個(gè)月母親葉酸的補(bǔ)充情況：孕前三月內(nèi)服用葉酸≥0.4mg/d;孕前三個(gè)月未服用葉酸或服用葉酸<0.4mg/d。

1.3DNA提取 采集新鮮血液及唾液，嚴(yán)格按照基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取兩組總DNA，用 NanoDrop2000 分光光度計(jì)(ThermoScientific 公司) 檢測其濃度及純度，所提DNA濃度均≥20ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0之間。-80℃冰箱低溫保存。

1.4Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 Primer5設(shè)計(jì)MTHFR基因A1298C位點(diǎn)基因片段擴(kuò)增引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)。用96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體積20μL，包含Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10μL、PCR上下游引物各0.4μL、TaqMan熒光探針各0.8μL、ROX reference Dye 0.4μL、DNA模板1μL、滅菌蒸餾水(dH2O)6.0μL。用7500Fast Real-Time PCR System(美國ABI公司)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增條件為:60℃1min，95℃5min，95℃15s，55℃20s，65℃50s，共40個(gè)循環(huán);60℃ 1min。上游引物：5-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3；下游引物：5-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，基因型及等位基因頻率分布進(jìn)行哈迪溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，如果兩組基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡則采用卡方檢驗(yàn)比較兩組基因型和等位基因分布的差異，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查表運(yùn)用SPSS軟件分析葉酸攝入與唇腭裂的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1MTHFR基因A1298C多態(tài)性分析 經(jīng)過HWE平衡檢驗(yàn)，觀察組和對照組的基因型、等位基因頻率分布均符合HWE平衡檢驗(yàn)(P>0.05)，見表1。所有患者均來自皖北地區(qū)，提取DNA的濃度為40～220ng/μL，由于DNA的濃度及純度已知，我們可以對qPCR的體積進(jìn)行調(diào)整。結(jié)果顯示，患者A1298C中C等位基因的頻率大于A等位基因的頻率，A1298C MTHFR SNP的AA純合性為2%。雜合子CA的頻率為46%,突變純合子CC頻率為52%。觀察組與對照組的基因型構(gòu)成比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.195，P<0.05) ，等位基因構(gòu)成比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.007，P=0.001)。對MTHFR基因A1298C C等位基因進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出攜帶C等位基因的新生兒患唇腭裂的風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶C等位基因患兒的2.625倍(OR=2.625，95%CI: 1.473～4.677)， 見表2。CC純合子與非CC純合子相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.897，P<0.05)。CC純合子患NSCL/P的危險(xiǎn)性是非CC純合子的 3.110倍 (OR=3.110，95%CI: 1.765～5.481) ，見表3。

2.2葉酸攝入與 NSCL/P發(fā)病的關(guān)系 葉酸攝入與NSCL/P發(fā)病相關(guān)(χ2=9.547，P=0.002，P<0.05，OR=2.379,95%CI=1.366～4.144),其中孕早期未服用或服用葉酸不足量與NSCL/P發(fā)病呈正相關(guān),即孕早期服用葉酸越少,NSCL/P的患病風(fēng)險(xiǎn)越高，見表4。

表1 MTHFR基因A1298C 基因型頻率分布與Hardy-Weinberg 平衡

表2 兩組 MTHFR 基因 A1298C 多態(tài)位點(diǎn)基因型與等位基因比較[例(%)]

表3 兩組CC純合子及非CC純合子比較(例)

表4 兩組孕婦葉酸攝入及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(例)

注：Status1：孕早期葉酸攝入充足。Status2：孕早期葉酸攝入不足。

3 討論

NSCL/P的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，易感基因較多，在不同地區(qū)的人群中其易感基因的分布特征及相關(guān)性研究結(jié)果也不相同，常受多個(gè)基因調(diào)控；同時(shí)又受環(huán)境因素影響，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，所以這種高度遺傳變異性、基因微效性的特點(diǎn)使得NSCL/P在易感性、相關(guān)性、致病基因的研究方法上比SCL/P復(fù)雜得多。

MTHFR基因的缺陷將導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)基礎(chǔ)生化過程的紊亂，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、DNA以及蛋白質(zhì)甲基化修飾等，并進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)管缺陷、癌癥、心腦血管疾病等多種病癥。MTHFR基因的缺陷對孕婦會引起胎兒神經(jīng)管缺陷、先天性心臟病、唇腭裂、妊娠期高血壓疾病、自發(fā)性流產(chǎn)。NSCL/P的發(fā)生涉及到多個(gè)重要SNPs位點(diǎn)，其中MTHFR基因A1298C就是重要位點(diǎn)之一。該位點(diǎn)A→C突變可引起氨基酸序列中谷氨酸被丙氨酸取代，導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性和活性降低，最終影響血漿中葉酸和同型半胱氨酸的水平[8]。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對于MTHFR基因A1298C位點(diǎn)的研究不多，因種族差異、遺傳背景、環(huán)境因素等不同，其位點(diǎn)的研究成果在各個(gè)地區(qū)不盡相同。2018年李三華等[9]研究了MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性與黔北地區(qū)人群NSCL/P的關(guān)系,結(jié)果顯示A1298C位點(diǎn)可能與NSCL/P無關(guān)。2015年Ebadifar A等[10]研究了伊朗德黑蘭人群MTHFR基因C677T與A1298C位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)C677T與NSCL/P相關(guān)，而A1298C無關(guān)。2013年劉明等[11]研究了MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性與山西地區(qū)人群NSCL/P的關(guān)系,結(jié)果顯示A1298C位點(diǎn)與NSCL/P相關(guān)。2011年Blanton等[12]針對美國患者人群NSCL/P的研究結(jié)果顯示，葉酸代謝途徑中MTHFR C677T和A1298C位點(diǎn)多態(tài)性均能夠促進(jìn)NSCL/P的發(fā)生。2006年萬偉東等[13]研究了江蘇、安徽地區(qū)人群MTHFR基因A1298C和C677T基因，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性可能是中國人群NSCL/P的遺傳易感因素,而C677T位點(diǎn)與中國人群NSCL/P的發(fā)生相關(guān)。

葉酸別名蝶酰谷氨酸，屬于B族維生素，是人體所需的重要營養(yǎng)素，存在于豆類、蘿卜、綠葉蔬菜(如菠菜)和一些水果(如柑橘類水果)中。在體內(nèi)葉酸以四氫葉酸的形式起作用，并作為一碳單位的供體，參與DNA氧化損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖及組織生長、幫助蛋白質(zhì)的代謝，并與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟[14,15]，與一些先天性疾病的關(guān)系密切。孕早期補(bǔ)充葉酸可以降低先天性神經(jīng)管畸形、先天性心臟病以及NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Jahanbin A等[16]的Meta分析提示含葉酸的圍生復(fù)合維生素對口腔裂隙具有保護(hù)作用,Dien VHA[17]在越南的研究結(jié)果顯示，在圍生期口服補(bǔ)充葉酸和多種維生素減少了口面裂隙的風(fēng)險(xiǎn)。并建議對于計(jì)劃懷孕的越南婦女，需圍手術(shù)期服用葉酸補(bǔ)充劑。Yang W等[18]在加州中部研究了1999～2010年葉酸強(qiáng)化后神經(jīng)管畸形患病率下降趨勢較小，口腔面裂患病率下降趨勢加速，同時(shí)腹裂患病率上升趨勢較慢。但De-Regil LM[19]數(shù)據(jù)顯示，葉酸單獨(dú)或與維生素和礦物質(zhì)結(jié)合使用，可以預(yù)防神經(jīng)管畸形，但對NSCL/P及其他先天缺陷沒有明顯的效果。本研究發(fā)現(xiàn)孕早期葉酸不攝入或攝入量過低會增加NSCL/P的患病風(fēng)險(xiǎn),并且葉酸攝入與NSCL/P發(fā)病相關(guān)。人體內(nèi)無法合成葉酸,只能從食物中獲取,且人體內(nèi)僅有一部分葉酸可供利用?；钚匀~酸數(shù)量受葉酸攝入量的多少及葉酸代謝路徑的影響,若活性葉酸數(shù)量下降會導(dǎo)致核苷酸合成異常及一碳單位供應(yīng)障礙，則會擾亂正常的DNA甲基化程序，進(jìn)而引起基因印記,X染色體失活,基因特異性表達(dá)等過程無法正常進(jìn)行,導(dǎo)致死胎、先天性畸形等胚胎發(fā)育異常。兩次表觀遺傳重編程出現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期,分別是基因組的快速去甲基化和重新甲基化。唇腭部發(fā)育期在胚胎發(fā)育的早期,這個(gè)時(shí)期體內(nèi)活性葉酸缺乏導(dǎo)致發(fā)生異常的DNA甲基化程序，從而增加NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本次研究在皖北地區(qū)人群中采用病例對照研究方法，同時(shí)結(jié)合孕婦流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，MTHFR基因A1298C位點(diǎn)多態(tài)性與NSCL/P可能存在關(guān)聯(lián)，并且孕早期葉酸攝入不足與唇腭裂發(fā)生率成正比。因此建議處于育齡女性，每天服用包括0.4～0.8 mg葉酸在內(nèi)的多種維生素補(bǔ)充劑，并保持健康的飲食和生活方式。本次研究進(jìn)行了初步的探討，唇腭裂發(fā)病因素復(fù)雜，涉及基因-基因、基因-環(huán)境的相互作用，需要排除其他復(fù)雜環(huán)境因素再進(jìn)行更多的前瞻性研究以進(jìn)一步調(diào)查孕婦補(bǔ)充葉酸與唇腭裂發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間、環(huán)境與NSCL/P之間的關(guān)系，為NSCL/P的預(yù)防及優(yōu)生優(yōu)育提供理論依據(jù)。