王忠江，李 澤，王貴祥，王子越，孫 瑋，姚紀宇

（東北農(nóng)業(yè)大學工程學院，哈爾濱 150030）

微藻為通過光合作用自養(yǎng)低等植物，適應能力較強，分布廣泛，光照、溫度、二氧化碳、pH和營養(yǎng)物質(zhì)（N、P、K、Mg 等）適宜條件下生長迅速[1]。微藻細胞含有豐富油脂、維生素、蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸和糖類等高附加值物質(zhì)。小球藻為微藻領域研究較多藻種[2]。小球藻富含天然β-胡蘿卜素和葉黃素，有較強抗氧化能力，對新陳代謝產(chǎn)生的自由基有去除效果，廣泛應用于醫(yī)藥行業(yè)[3]。改變培養(yǎng)環(huán)境提高小球藻中油脂含量，油脂經(jīng)熱解和提純后可作為生物燃油[4]。小球藻吸收富營養(yǎng)化水體中N、P、K 等物質(zhì)，對重金屬水凈化效果明顯[5]。目前獲取小球藻主要通過培養(yǎng)基培養(yǎng)方法，在配制培養(yǎng)基時需添加大量N、P、K 和C等營養(yǎng)成分及微量元素，主要依賴化學試劑，增加小球藻生產(chǎn)成本[6]。研發(fā)高性價比氮磷培養(yǎng)基質(zhì)成為后續(xù)微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵。

我國豬場數(shù)量龐大，多以規(guī)模化養(yǎng)殖為主，每年產(chǎn)生大量豬場廢水。豬場廢水具有濁度高、臭味大、污染物濃度高，富含有機物、NH3-N、SS、TP等特點，如未經(jīng)處理直接排放將成為污染源。目前豬場廢水處理是制約我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問題。

利用富含氮磷豬場廢水培養(yǎng)小球藻，可有效處理豬場廢水并顯著降低微藻培養(yǎng)成本[7-8]。利用豬場廢水開展微藻培養(yǎng)研究中，需先對廢水作高溫、高壓、臭氧等滅菌預處理[9-10]，過程工序繁雜，增加微藻培養(yǎng)成本。因此，本文針對豬場廢水特點，以及目前豬場廢水用于微藻培養(yǎng)存在問題，探討未滅菌豬場廢水直接培養(yǎng)小球藻可行性并優(yōu)化培養(yǎng)工藝。

1 材料與方法

1.1 廢水預處理

豬場廢水取自黑龍江省哈爾濱市香坊區(qū)幸福鎮(zhèn)光明村。取回豬場廢水先用紗布過濾浮渣等雜質(zhì)后取其清液，過濾后豬場廢水pH 7.36，TN 4 857.32 mg·L-1，NH3-N 4 385.63 mg·L-1，TP 145.37 mg·L-1，COD 22 364.42 mg·L-1，濁度3 252.53 NTU。原豬場廢水中氨氮和COD 含量較高，為避免對后續(xù)小球藻培養(yǎng)產(chǎn)生抑制，將原廢水稀釋10倍后作為小球藻培養(yǎng)液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 藻種及培養(yǎng)

蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，藻種編號為FACHB-5，小球藻在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期后備用。

1.3 方法

1.3.1 豬場廢水培養(yǎng)小球藻單因素試驗

廢水添加比單因素試驗：將豬場廢水和BG11培養(yǎng)基混合物作為小球藻培養(yǎng)基，廢水添加比設定為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%，將預先擴培同一批次小球藻接種至豬場廢水混合培養(yǎng)液。每個試驗組設3 個平行，小球藻初始接種OD680為0.1（±0.05）， 調(diào)節(jié)pH 7.0，光照強度4 000 lx， 溫度（26 ± 1）℃， 曝氣強度2.0 L·min-1，光照周期為24 h/0 h（L∶D），培養(yǎng)周期為4 d。每日定時搖瓶并取樣測量OD680，確定優(yōu)化廢水添加比范圍。

初始pH 單因素試驗：設定廢水添加比為20%，將小球藻培養(yǎng)液初始pH調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0 和11.0，每個試驗組設3 個平行，培養(yǎng)周期為4 d，每日定時搖瓶，取樣測量OD680，確定優(yōu)化初始pH范圍。

光照強度單因素試驗：設定廢水添加比為20%，調(diào)節(jié)pH 7.0，分別以2 000、4 000、6 000、8 000 和10 000 lx 光照強度培養(yǎng)4 d，每個試驗組設3 個平行，每日定時搖瓶，取樣測量OD680，確定優(yōu)化光照強度范圍。

1.3.2 二次正交旋轉(zhuǎn)中心組合試驗設計

二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗因素水平編碼如表1所示。溫度為（26±1）℃，曝氣強度為2.0 L·min-1，光照周期為24 h/0 h（L∶D），培養(yǎng)周期為10 d。

以廢水添加比x1、初始pH x2和光照強度x33個因素為變量，以小球藻生物量和氨氮去除率為響應指標Y1和Y2，通過統(tǒng)計分析建立多元回歸方程，確定各因素對小球藻生物量和氨氮去除率的影響，利用Excel 2003和SAS軟件優(yōu)化豬場廢水培養(yǎng)小球藻工藝。

1.4 分析方法

小球藻生物量測定采用光密度法：培養(yǎng)液中小球藻細胞密度與其在680 nm 處光密度值線性相關(guān)[11]，用紫外可見分光光度計（UV754N上海儀電分析儀器有限公司）測定活體藻液在680 nm處光密度值代表細胞密度。另因藻細胞密度較高，吸光值大于1培養(yǎng)液，在測定前適當稀釋，使其測定值在0～1。氨氮使用荷蘭SKALAR 連續(xù)流動分析儀測定，采用Excel 2003 和SAS 處理數(shù)據(jù)；采用Excel 2003分析差異顯著性。

表1 因素水平編碼Table 1 Experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 廢水添加比對小球藻生長影響

豬場廢水添加比對小球藻生長的影響如圖所示。

由圖1可知，小球藻在廢水添加比小于50%培養(yǎng)液中均正常生長，廢水添加比為20%組OD 值最高，第4 天時OD680達到最大值0.673，10%組次之，而50%組OD680雖呈升高趨勢，但增速較低，說明廢水添加比為50%時已對小球藻生長產(chǎn)生抑制作用。

當廢水添加比為60%及以上時，各試驗組OD680值在經(jīng)前2 d 短暫停滯期后逐漸下降，隨廢水添加比升高，OD680值下降，速率升高，此時各試驗組小球藻生長均受明顯抑制，藻體大量絮凝沉淀在瓶底和瓶壁。由于廢水添加濃度較高時，培養(yǎng)液中氨氮含量超過小球藻耐受閾值導致其死亡。本試驗適宜廢水添加比范圍為10%～50%。

2.1.2 初始pH對小球藻生長影響

初始pH 對小球藻生長影響如圖2 所示?？芍?，初始pH對小球藻生長影響較大。除初始pH為11.0 組OD680值基本保持不變外，其他各組OD680值在經(jīng)歷第1天快速升高后，從第2天開始各組OD680值變化規(guī)律出現(xiàn)差異，其中初始pH 為9.0 組OD680值處于上升趨勢，而初始pH為5.0和7.0組OD680值從第2 天開始仍處于上升趨勢，但上升速率與第1天相比均出現(xiàn)下降，初始pH 為5.0 組OD680值上升速率下降幅度較大。初始pH 為7.0 組OD680值上升速率下降后與初始pH 為9.0 組保持一致，試驗結(jié)束時初始pH7.0 組OD680值達到2.213，為各試驗組中最高。而初始pH 為3.0 組OD680值在經(jīng)過第1 天上升后開始逐漸下降，第3 天時OD680值與初始pH為11.0 組OD680值持平，第4 天時OD680值甚至低于初始pH 為11.0 組。說明小球藻生長環(huán)境pH 適宜，初始pH為7.0中性環(huán)境更適宜小球藻生長[12]。本試驗適宜初始pH范圍為5.0～9.0。

2.1.3 光照強度對小球藻生長影響

光照強度對小球藻生長影響如圖3所示。

由圖3 可知，光照強度對小球藻生長影響較大。5個試驗組OD680值變化呈一定規(guī)律，其中光照強度較低2 000 和4 000 lx 試驗組OD680值均較低，兩個試驗組OD680值差別較小。由于豬場廢水濁度較高，光透過性差，當光照強度較低時無法充分滿足小球藻生長需要，致使光照強度較低2 000和4 000 lx 試驗組OD680值均較低。隨光照強度增加，各試驗組OD680值增加，光照強度為8 000 lx 組OD680值處于較高水平。但當光照強度繼續(xù)升高到10 000 lx 時，OD680值未升高，反而由8 000 lx 時0.973 降至0.682，與光照強度6 000 lx 試驗組OD680值一致，說明光照強度并非越高越好。在本研究中10 000 lx 光照強度已超過小球藻光飽和范圍，影響小球藻正常生長，與羅淋研究結(jié)果[13]一致。本試驗適宜光照強度范圍為6 000～10 000 lx。

2.2 正交旋轉(zhuǎn)組合試驗

為確定各因素間交互作用，優(yōu)化豬場廢水培養(yǎng)小球藻工藝條件，設計3因素5水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，分別以OD680和氨氮去除率為響應值Y1和Y2，分析廢水添加比、初始pH、光照強度對試驗結(jié)果影響。

正交設計與結(jié)果如表2所示。

表2 正交設計與結(jié)果Table 2 Test plan and experimental data

2.2.1 方差分析

2.2.1.1 OD680

根據(jù)試驗結(jié)果，利用SAS 軟件作多元線性二次回歸分析，得到回歸模型并檢驗模型。經(jīng)失擬性檢驗后可知，失擬平方和P=0.8059＞0.05 不顯著，回歸方程有意義。從回歸方程方差分析可知回歸方程P＜0.0001 高度顯著，響應值與因素之間存在模型確定關(guān)系，說明所選模型合理；由回歸方程回歸系數(shù)檢驗可知OD680與各因素一級線性關(guān)系均高度顯著；與x1×x2和x2×x3線性關(guān)系高度顯著。最終得到響應值OD680與x1、x2、x3回歸方程模型為：

Y1=2.807-0.338x1+0.344x2+0.079x3-0.047x1x2-0.005x1x3-0.05x2x3-0.038x12-0.496x22-0.228x32

將不顯著回歸項去掉，得到OD680與各因素間回歸方程為：

Y1=2.807-0.338x1+0.344x2+0.079x3-0.047x1x2-0.05x2x3-0.038x12-0.496x22-0.228x32

2.2.1.2 氨氮去除率

經(jīng)失擬性檢驗可知，失擬平方和P=0.2115＞0.05不顯著，回歸方程有意義。從回歸方程方差分析可知回歸方程P＜0.0001 高度顯著，氨氮去除率與自變量之間為顯著回歸關(guān)系，說明所選模型合理；由回歸方程回歸系數(shù)檢驗可知單因素對響應值影響均極顯著；兩兩交互作用中x1×x2和x2×x3線性關(guān)系高度顯著。最終得到響應值氨氮去除率與x1、x2、x3回歸方程模型為：

Y2=0.857- 0.102x1+ 0.1x2+ 0.027x3- 0.023x1x2-0.003x1x3-0.0023x2x3-0.081x12-0.157x22+0.857x32

將不顯著回歸項去掉，得到氨氮去除率與各因素間回歸方程為：

Y2=0.857- 0.102x1+ 0.1x2+ 0.027x3- 0.023x1x2-0.0023x2x3-0.081x12-0.157x22+0.857x32

2.2.2 響應曲面分析

為研究廢水添加比、初始pH 和光照強度間交互作用，利用SAS 軟件繪制響應曲面圖和等高線圖，并分析各因素間兩兩交互作用，確定最佳因素水平范圍，得到最優(yōu)因素組合及最優(yōu)工藝，確定最大響應值。

本研究中廢水添加比與光照強度交互作用對OD680和氨氮去除率影響不顯著，因此未作分析。其余因素兩兩交互作用響應曲面圖和等高線圖如圖4～7所示。

光照強度為8 000 lx時，初始pH和廢水添加比對小球藻生物量影響見圖4。

由圖4a可知，響應值OD680在初始pH方向坡度較大，即OD680受初始pH 影響更顯著，且隨初始pH增大，小球藻OD680在一定范圍內(nèi)逐漸增大；但當pH大于7.4后，隨初始pH增大，小球藻OD680反而逐漸降低，與單因素試驗得出小球藻OD680隨初始pH變化規(guī)律一致。廢水添加比對OD680影響也是先增后減。當初始pH 為7.44，廢水添加比為24.3%時OD680達到最大2.95。由圖4b 可見，等高線沿初始pH方向分布更密集，說明初始pH與廢水添加比相比對OD680影響更大。當廢水添加比在21%～28%，初始pH在7.2～7.7時OD680值較高。

廢水添加比為30%時，初始pH 和光照強度對小球藻生物量影響情況見圖5。由圖5a可知，最大值位于試驗區(qū)內(nèi)部，表明得到小球藻最大生物量。圖5b 可知，等高線沿初始pH 方向分布更密集，說明初始pH 與光照強度相比對OD680影響更大。當初始pH 在7.1～7.8，光照強度在7 600～8 800 lx范圍時OD680較高。

光照強度為8 000 lx時，廢水添加比與初始pH對廢水中氨氮去除率影響見圖6。可見，氨氮去除率OD680隨廢水添加比與初始pH變化規(guī)律一致，初始pH對氨氮去除率影響更大，說明氨氮去除與小球藻生物量增加直接相關(guān)，氨氮作為小球藻營養(yǎng)被利用，與馬紅芳等研究結(jié)果[14]一致。由圖6b 可見，廢水添加比和初始pH存在明顯交互作用，最佳氨氮去除率在試驗區(qū)域內(nèi)，當廢水添加比在19%～24%，初始pH 7.1～7.5 時，廢水氨氮去除率較高。

廢水添加比為30%時，初始pH 和光照強度對氨氮去除率影響情況見圖7?？梢?，氨氮去除率與圖5 中OD680隨廢水添加比和初始pH 變化規(guī)律一致，初始pH與光照強度相比對氨氮去除率影響更大，隨初始pH增大而增大；但當初始pH＞7.4，氨氮去除率隨初始pH增大而減小。由圖7b可知，廢水添加比和初始pH存在明顯交互作用，最佳氨氮去除率在實驗區(qū)域內(nèi)，當初始pH在7.1～7.7，光照強度在7 700～8 500 lx時，廢水氨氮去除率較高。

2.2.3 參數(shù)尋優(yōu)

為確定豬場廢水作為營養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻最佳工藝條件參數(shù)，本文使用Matlab Optimization Toolbox，使用fminimax 函數(shù)模塊，采用序列二次規(guī)劃算法對回歸模型作有約束目標優(yōu)化求解。多目標優(yōu)化初始參數(shù)、邊界值和返回值如表3所示。

當培養(yǎng)條件設定為廢水添加比21.75%，初始pH 7.44，光照強度8 150 lx 時，可達到OD680與氨氮去除率理論最大值。OD680最大值為2.9375，氨氮去除率最大值為91.25%。

表3 工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果Table 3 Optimum analysis of technology parameters

2.2.4 驗證分析

為檢驗最終模型可靠性，采用廢水添加比21.75%、初始pH 7.44、光照強度8 150 lx較優(yōu)工藝參數(shù)培養(yǎng)小球藻，開展驗證試驗。經(jīng)10 d 培養(yǎng)后OD680達到2.91，廢水中氨氮去除率為89.54%，與理論預測值較為接近，兩個指標理論值和實際值誤差均在2%內(nèi)，說明本研究模型模擬效果良好。

3 討 論

目前針對豬場廢水開展微藻培養(yǎng)研究均需先對廢水作高溫、高壓等滅菌預處理，增加豬場廢水培養(yǎng)微藻難度及成本，本研究以未滅菌處理豬場廢水作小球藻培養(yǎng)。單因素試驗通過豬場廢水添加比研究發(fā)現(xiàn)，當廢水添加比小于50%時，小球藻在未滅菌豬場廢水混合液中均正常生長，表明未滅菌豬場廢水可直接用于培養(yǎng)小球藻。通過研究小球藻培養(yǎng)液初始pH 發(fā)現(xiàn)，小球藻在初始pH 5～9 時生長狀況較好，其中以pH 為7 中性環(huán)境生長最佳，說明小球藻更適于中性生長環(huán)境。通過對光照強度研究發(fā)現(xiàn)，由于豬場廢水濁度較高，當光照強度處于2 000～4 000 lx 較低水平時，小球藻生長速率較低，隨光照強度增加，小球藻生長速率也隨之增加，光照強度為8 000 lx 時小球藻生長速率達較高水平，但光照強度繼續(xù)升至10 000 lx 時，OD680值下降，說明光照強度并非越高越好。

正交旋轉(zhuǎn)組合試驗可見，廢水添加比與光照強度交互作用較弱，而初始pH與廢水添加比和光照強度交互作用較強，初始pH與廢水添加比和光照強度相比對OD680和氨氮去除率影響更顯著。研究表明，培養(yǎng)液中氨氮去除與小球藻生物量增加相關(guān)，說明氨氮主要作為小球藻營養(yǎng)，小球藻具有較高降解和利用廢水中氨氮能力，可用于高氨氮廢水處理。本試驗中的小球藻為批量培養(yǎng)，培養(yǎng)周期相對較短，后續(xù)需開展小球藻連續(xù)培養(yǎng)研究，驗證和優(yōu)化豬場廢水在小球藻長期連續(xù)培養(yǎng)過程中工藝控制參數(shù)，為不滅菌豬場廢水直接開展微藻培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

4 結(jié) 論

a. 未滅菌豬場廢水可直接用于小球藻培養(yǎng)，通過單因素試驗確定廢水添加比、初始pH和光照強度對小球藻生物量影響規(guī)律。

b.通過二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，確定廢水添加比、光照強度和初始pH對小球藻生物量和廢水氨氮去除率影響數(shù)學模型，并確定豬場廢水培養(yǎng)小球藻最佳工藝條件為廢水添加比21.75%，初始pH 7.44，光照強度8 150 lx。