劉晨斌 ，徐革鋒，黃天晴，谷 偉，陳春生，程 琳，史秀蘭，王炳謙*

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102100）

褐鱒營(yíng)養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值俱佳，是西藏亞東地區(qū)重點(diǎn)養(yǎng)殖魚種[1]。近年來，西藏交通運(yùn)輸環(huán)境逐漸優(yōu)化，促進(jìn)褐鱒養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，但發(fā)病率持續(xù)升高[2]。為控制病害，抗生素等化學(xué)類藥物大量使用，病原微生物對(duì)藥物產(chǎn)生較強(qiáng)抗藥性，且抗生素在水中殘留污染水生環(huán)境[3]?？咕木哂袕V譜抗性，無殘留，相對(duì)分子質(zhì)量較小，不會(huì)導(dǎo)致耐藥性，可有效替代抗生素。

肝臟表達(dá)抗菌肽2（Liver-expressed antimicrobial peptide-2，LEAP-2）產(chǎn)生于肝臟，隨后進(jìn)入血液，通過血液循環(huán)產(chǎn)生抗菌效果。Krause等最初通過分離人類血液，得到肝臟表達(dá)抗菌肽1（Hepcidin）和抗菌肽2，在抗微生物活性方面，LEAP-2更強(qiáng)，血液中形成長(zhǎng)度不一的多肽，具有抗菌作用[4]。魚類中LEAP-2 最早發(fā)現(xiàn)于虹鱒（Oncorhynchus mykiss），具有兩種類型，分別為L(zhǎng)EAP-2A和LEAP-2B[5]。至今已有較多魚類LEAP-2基因被克隆鑒定，其中包括大黃魚（Larimichthys crocea）[6]、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]、牙 鲆（Paralichthys olivaceous）[8]、藍(lán)色鯰魚（Ictalurus furcatus）[9]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[10]、日本鰻鱺（Anguilla japonica）[11]等。

褐鱒LEAP-2研究有助于了解該基因在褐鱒免疫系統(tǒng)中的作用，利于褐鱒健康養(yǎng)殖和野生資源保護(hù)。本研究克隆褐鱒LEAP-2基因，分析其分子特征，構(gòu)建pET32a-mLEAP-2 重組表達(dá)載體對(duì)其原核表達(dá)，為進(jìn)一步探究LEAP-2抗菌功能奠定基礎(chǔ)，為褐鱒健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

成年健康褐鱒（平均體長(zhǎng)37～38 cm，體重700～750 g）取自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站。經(jīng)麻醉后迅速解剖，取肝臟組織約400 mg，置于1.5 mL 離心管，液氮迅速冷凍樣品，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取

采用Trizol 試劑（Invitrogen，美國），按試劑使用說明提取褐鱒肝臟組織總RNA（100 mg∶1 mL），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國）測(cè)定總RNA濃度和純度。

1.3 LEAP-2基因開放閱讀框序列

采用同源克隆方法，通過Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，L2-F：TGCAGGACCGTCAACACTAC，L2-R：GATGGGTTGGCTGAACATGC。以提取的褐鱒肝臟組織總RNA 為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒BioRT Master HiSensi cDNA First Strand Synthesis Kit（博日科技有限公司，杭州）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以L2-F和L2-R為引物PCR擴(kuò)增。凝膠回收試劑盒TaKa-Ra MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0（TaKaRa，日本）對(duì)擴(kuò)增目的片段回收、純化，與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)。對(duì)PCR檢測(cè)為陽性菌落測(cè)序。

1.4 序列特征生物信息學(xué)分析

通過Blast 在線程序分析序列相似性，同時(shí)利用DNAman 9.0 軟件將褐鱒LEAP-2 與多種動(dòng)物L(fēng)EAP-2 序列作多序列比對(duì)。比對(duì)動(dòng)物包括：人（Homo sapiens，NP_443203.1）、豬（Sus scrofa，NP_998953.1）、牛（Bos Taurus，NP_776984.1）、小鼠（Mus musculus，NP_694709.1）、獼猴（Macaca mulatta，NP_001107582.1）、紅 原 雞（Gallus gallus，NP_001001606.1）、狒狒（Papio anubis，NP_00116 2235.1）、狗（Canis lupus familiaris，XP_852172.1）、大西洋鮭（Salmo salar，XP_014039283.1）、紅點(diǎn)鮭（Salvelinus alpinus， XP_023996429.1）、虹 鱒（Oncorhynchus mykiss）LEAP-2A 型（NP_001117936.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）LEAP-2B 型（NP_0011179 37.1）、草魚（Ctenopharyngodon idella）（ACR54299.1）、黃顙魚（Tachysurus fulvidraco，XP_026990153.1）、長(zhǎng)鰭真鮰（Ictalurus furcatus，AAX45792.1）、斑馬魚（Danio rerio，NP_001122249.1）、 大黃魚（Larimichthys crocea，NP_001290271.1）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，XP_019960564.1）以及斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001187134.1）。

采用MEGA 5.0 構(gòu)建上述物種LEAP-2 系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用SignalP 3.0 預(yù)測(cè)褐鱒LEAP-2 信號(hào)肽序列。利用NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；利用NetNGlyc 1.0 Server 和NetOGlyc 4.0 Server 分別預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)；利用ProtParam預(yù)測(cè)理化屬性；利用SWISS-MODEL 和PredictProtein預(yù)測(cè)編碼蛋白結(jié)構(gòu)。

1.5 LEAP-2成熟肽融合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計(jì)一對(duì)含Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)引物，上游引物L(fēng)2YH-F：CCGGAATTCATGACCCCGTTGTGGAGG（下劃線表示含3個(gè)保護(hù)堿基+Eco RⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物L(fēng)2YH-R：CCGCTCGAGA TGTTTGGCTATGTAGAGGAGAGG（下劃線表示含3 個(gè)保護(hù)堿基+XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以褐鱒肝臟組織cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)。對(duì)PCR 檢測(cè)為陽性菌落作序列測(cè)定，序列正確菌落液體培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒小提試劑盒Biospin Plasmid DNA Extraction Kit（博日科技有限公司，杭州）提取pMD18-T-mLEAP-2 重組質(zhì)粒。用Eco R Ⅰ和Xho Ⅰ分別對(duì)pMD18-TmLEAP-2 和pET32a 質(zhì)粒（豐暉生物，湖南）雙酶切，將雙酶切后純化得到帶有相同黏性末端成熟肽mLEAP-2 和pET32a 載體片段連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)。將PCR 檢測(cè)為陽性菌落過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對(duì)提取質(zhì)粒雙酶切鑒定。測(cè)序鑒定正確質(zhì)粒，將測(cè)序正確質(zhì)粒保存于-20 ℃。

1.6 LEAP-2成熟肽在大腸桿菌中表達(dá)

取1 μL pET32a-mLEAP-2 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，在含100 μg·mL-1氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1∶100 比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃，120 r·min-1振搖培養(yǎng)至OD 約為0.5，取出3 mL 菌液作為陰性對(duì)照，其余菌液加入1 mol·L-1IPTG 使終濃度為0.25 mmol·L-1誘導(dǎo)其表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，每隔1 h 取樣1 次，將收集菌液4 ℃10 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，PBS洗1次，取菌體于5×SDS-PAGE上樣緩沖液中，煮沸15 min裂解，裂解液作SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。含pET32a 空質(zhì)粒的BL21（DE3）菌體作對(duì)照，處理?xiàng)l件與試驗(yàn)組相同。另收集誘導(dǎo)4 h菌體，PBS洗后超聲破碎，離心后獲得上清液和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐鱒LEAP-2基因開放閱讀框序列的克隆

采用同源克隆方法，得到褐鱒LEAP-2的ORF序列，全長(zhǎng)291 bp，編碼96個(gè)氨基酸（見圖1）。利用ProtParam 分析褐鱒LEAP-2 基本物理化學(xué)參數(shù)，分子式為C478H739N133O130S11，總原子數(shù)為1491個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為10.78 ku，理論pI 值為9.19，不穩(wěn)定系數(shù)為63.71，親水性平均系數(shù)為-0.123。SignalP 3.0 分析顯示褐鱒LEAP-2 含有一個(gè)潛在信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)位于Ala27和Ser28，自氨基端起1-27 殘基為信號(hào)肽區(qū)域。功能位點(diǎn)分析顯示褐鱒LEAP-2存在4個(gè)絲氨酸（Ser）和3個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)， 4 個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（分別在第32、38、39 和62 位氨基酸位點(diǎn)），不存在酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)。通過PredictProtein預(yù)測(cè) 顯 示Cys-72 與Cys-78 和Cys-83 與Cys-88 之間分別形成2對(duì)二硫鍵。

預(yù)測(cè)褐鱒LEAP-2 三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2。通過搜索發(fā)現(xiàn)，人類LEAP-2（PDB number:2l1q.1.A）與褐鱒LEAP-2 蛋白序列最匹配，序列一致性為41.03%，QMEAN 值為-1.61。從結(jié)構(gòu)上看，褐鱒LEAP-2 與人類LEAP-2 相似，其中包括由2 對(duì)二硫鍵組成的緊密中心及無序N端和C端。

2.2 褐鱒與其他生物L(fēng)EAP-2氨基酸序列比較

分析和比對(duì)褐鱒與其他物種LEAP-2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)褐鱒與大西洋鮭同源性最高，達(dá)99%；與模式魚種斑馬魚同源性為55.2%；與紅原雞同源性為29.2%；與人類同源性為27.1%；與小鼠同源性最低，為22.5%（見表1）。

褐鱒與上述動(dòng)物L(fēng)EAP-2 比對(duì)結(jié)果見圖3，在羧基端具有多個(gè)保守氨基酸殘基，其中包括4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基（星號(hào)標(biāo)出），在這4個(gè)半胱氨酸殘基之間形成2 對(duì)二硫鍵，2 對(duì)二硫鍵與LEAP-2 抗菌活性密切相關(guān)。

表1 褐鱒LEAP-2氨基酸序列的同源性分析Table 1 Homologous analysis of the amino acid sequence of brown trout LEAP-2

2.3 LEAP-2基因在不同物種間進(jìn)化分析

通過MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖4），主要有兩個(gè)分支，其中硬骨魚類形成一個(gè)分支，鳥類和哺乳動(dòng)物形成另一個(gè)分支，說明魚類與哺乳動(dòng)物和鳥類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在硬骨魚類分支中，褐鱒與大西洋鮭親緣關(guān)系最近，先形成一簇，再與其他魚類成簇。除大西洋鮭之外，褐鱒與同為鮭科的虹鱒A型和紅點(diǎn)鮭親緣關(guān)系也較近。

2.4 pET32a-mLEAP-2重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

提取陽性菌落中的質(zhì)粒，Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后顯示在約214 bp處可見目的片段條帶（見圖5）。測(cè)序鑒定正確質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果證明目的片段“mLEAP-2”已成功連接到pET32a 表達(dá)載體，核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

2.5 LEAP-2在E.coli中體外表達(dá)

含重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-mLEAP-2 大腸桿菌BL21（DE3）被培養(yǎng)至OD 值約為0.5 后，通過IPTG誘導(dǎo)，對(duì)誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6 h 菌體總蛋白作SDS-PAGE 電泳分析，同時(shí)取誘導(dǎo)4 h 菌體，經(jīng)超聲破碎后將獲得沉淀和上清分別作SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果如圖6所示，含重組質(zhì)粒菌體總蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量約22.61 ku處有蛋白條帶，與預(yù)期相符，而在含pET32a 空質(zhì)粒菌體總蛋白上未見該條帶，表明重組蛋白得到有效表達(dá)。另外，在菌體經(jīng)超聲破碎后離心得到上清和沉淀中均存在目的條帶，表明trxA-mLEAP-2融合蛋白除以可溶性蛋白形式表達(dá)外，還存在于包涵體中。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)克隆褐鱒LEAP-2基因ORF序列，分析其序列特征。通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，褐鱒與鳥類和哺乳類同源性均在30%以下，與草魚等非鮭科魚類和虹鱒LEAP-2B同源性40%～61%，與虹鱒LEAP-2A、紅點(diǎn)鮭和大西洋鮭同源性均在94%以上，其中與大西洋鮭同源性最高，達(dá)99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示結(jié)果也與上述分析相同，與分類上的親緣關(guān)系一致，說明褐鱒LEAP-2在進(jìn)化上相對(duì)保守。

該基因編碼96個(gè)氨基酸，自氨基端起前27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽部分，28～96個(gè)氨基酸為原前體肽部分，在Ala27和Ser28之間存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)；原前體肽由前體肽和成熟肽組成，在前體肽和成熟肽之間存在可被前體肽轉(zhuǎn)化酶識(shí)別的切割位點(diǎn)（RMAR-MT）。4 個(gè)高度保守半胱氨酸在羧基端形成2 對(duì)二硫鍵并構(gòu)成穩(wěn)定β-折疊結(jié)構(gòu)，更易穿過細(xì)胞膜殺死病原微生物[12]。研究證明，對(duì)昆蟲防御素使用二巰蘇糖醇還原分子內(nèi)二硫鍵，其抗菌活性消失[13]。因此2 對(duì)二硫鍵與LEAP-2 抗菌活性有關(guān)。

目前LEAP-2體外表達(dá)已有報(bào)道，王紅亮通過將小鼠LEAP-2 成熟肽cDNA 連入pPIC9 載體中，獲得pPIC9-LEAP-2 重組質(zhì)粒[14]。張虹等在對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰LEAP-2 基因全長(zhǎng)cDNA 改造后，將其插入pET-32a載體，BL21菌表達(dá)和純化獲取目的蛋白，以Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)斑點(diǎn)叉尾鮰LEAP-2在大腸桿菌BL21中表達(dá)[7]。蔡燦等將大黃魚LEAP-2全長(zhǎng)cDNA連入pET-32a載體，在體外表達(dá)大黃魚LEAP-2重組蛋白[6]。本試驗(yàn)以褐鱒LEAP為研究對(duì)象，構(gòu)建pET32a-mLEAP-2重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)后所得蛋白與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量一致，為22.61 ku，表明目的蛋白有效表達(dá)。

利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時(shí)，需注意外源蛋白對(duì)宿主菌“毒性”作用，避免“宿主菌自殺”[15]。因此本研究選擇pET32a作為表達(dá)載體，目的基因在pET32a載體上轉(zhuǎn)錄和翻譯受T7噬菌體信號(hào)控制，在加入IPTG后，大量T7 RNA聚合酶產(chǎn)生并與載體上T7 啟動(dòng)子結(jié)合，使目的重組蛋白高效表達(dá)；而未加入IPTG 時(shí)，目的基因無表達(dá)，宿主菌可良好生長(zhǎng)。另外，在pET32a 載體上具有trxA標(biāo)簽，蛋白可正確折疊，有效改善其溶解性能，減少包涵體蛋白形成。

本試驗(yàn)克隆得到褐鱒LEAP-2基因ORF序列，并在體外成功表達(dá)“trxA-mLEAP-2”重組蛋白，為進(jìn)一步研究褐鱒LEAP-2基因功能提供理論基礎(chǔ)。