李秀英，趙 婧，侯倩宜，高騰美，王穎莉

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中030619）

法舒地爾是一種蛋白激酶抑制劑，其在正?；虿±砬闆r下都能競爭性結(jié)合Rho 激酶催化區(qū)的ATP 位點，阻斷Rho 激酶的活性。法舒地爾注射液在臨床中常用于蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病癥狀的改善。研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾能改善動脈粥樣硬化患者的內(nèi)皮功能，減少動脈粥樣斑塊，而且可以有效擴(kuò)張血管，改善心力衰竭狀況，因此可以用于多種老年病的防治［1-2］。該類慢性病需長期治療，注射劑已不

能滿足臨床用藥需求，有必要開發(fā)更為適宜的口服制劑。復(fù)乳是一種良好的藥物載體，藥物被油膜包裹后可減少其在胃腸道的水解，降低副作用，增加吸收；并且具有一定的緩釋和靶向作用，可增強(qiáng)藥效，所以將復(fù)乳劑型應(yīng)用于法舒地爾口服給藥是解決水溶性法舒地爾口服代謝快、絕對生物利用度低（10.2%）［3］的一種潛在制劑手段。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器，Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），JA5003 分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），78-1 型磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），TGL18M 冷凍超高速離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司），雷磁DDS-11C 型電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），CX22 奧林巴斯顯微鏡，Zetasizer 3000 馬爾文激光散射粒徑測定儀（英國馬爾文公司）。

1.2 實驗試藥

鹽酸法舒地爾（Ark pharm 公司，批號：WG0130021-160517001，含量98%），蛋黃卵磷脂（EPC，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號160116），維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，上海譜振生物科技有限公司，批號ZY161029），蓖麻油（天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司），司班80（Span-80）、吐溫80（Tween 80）、磷酸二氫鉀溶液、氯仿（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙腈、甲醇（色譜純，廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 法舒地爾分析方法學(xué)的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5.0）-甲醇=84∶16；流速：1.0 mL/min；檢測波長：218 nm；進(jìn)樣量：20 μL［4］。

2.1.2 法舒地爾復(fù)乳供試品溶液制備 精密稱定法舒地爾復(fù)乳1.0 g，流動相超聲溶解后定容至10 mL，過濾，取續(xù)濾液2 mL 以流動相稀釋至10 mL，成為每毫升含0.02 g 的供試品溶液備用。

2.1.3 空白復(fù)乳供試品溶液制備 按照空白復(fù)乳的制備工藝，制備不含法舒地爾的空白復(fù)乳，并用2.1.2 項下方法制得相應(yīng)的空白復(fù)乳供試品溶液。

2.1.4 法舒地爾系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取5.03 mg 法舒地爾原料藥，置于25 mL 錐形瓶中，用蒸餾水定容至刻度，使其完全溶解，即得200.12 μg/mL 法舒地爾母液。分別精密移取法舒地爾母液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 置10 mL 容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，即可得到1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.01 μg/mL、20.01 μg/mL、50.03 μg/mL、100.06 μg/mL 法舒地爾系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品、空白復(fù)乳及法舒地爾復(fù)乳供試液各20 μL，按照上述“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣分析。法舒地爾色譜峰出現(xiàn)在5.7 min，空白復(fù)乳在相應(yīng)保留時間無色譜峰，因此空白復(fù)乳對法舒地爾無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述法舒地爾系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，按照上述色譜條件，測得峰面積（A），計算回歸方程A=71 098C-21 802，r=0.999 9，法舒地爾在1.00～100.06 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度實驗 精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.01 μg/mL）20 μL，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，法舒地爾的峰面積平均值為（689 875±2561），RSD為0.37%，結(jié)果表明精密度較好。

2.1.8 穩(wěn)定性實驗 取上述法舒地爾復(fù)乳供試液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 按照上述色譜條件測定。法舒地爾峰面積平均值為（7 062 215±41 667），RSD為0.59%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性實驗 取同批法舒地爾復(fù)乳，按供試品溶液制備方法制得6 份平行的供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。測得的法舒地爾峰面積的RSD為1.18%，表明該方法重復(fù)性好。

2.1.10 回收率實驗 取6 份空白復(fù)乳，每份1.0 g，分別加入法舒地爾溶液（100.06 μg/mL）0.1 mL，渦旋混勻，按照供試品溶液制備方法操作，測定法舒地爾平均回收率為98.02%，RSD為1.31%。

2.1.11 離心保留率 將法舒地爾復(fù)乳置于EP管中，用蒸餾水稀釋10 倍，室溫下，于3000 r/min 低速離心30 min，吸取下清液，按照“2.1.1”利用高效液相法測定藥物含量，根據(jù)公式離心保留率＝1-W1/W（W1表示離心后未包封于內(nèi)水相中的藥物量，W表示離心后未包封于內(nèi)水相中的藥物量與仍包封于內(nèi)水相中的藥物量之和即藥物總量），計算各處方的離心保留率［5］。

2.2 法舒地爾復(fù)乳的制備工藝與處方篩選

2.2.1 法舒地爾復(fù)乳的基本處方及制備工藝 采用兩步乳化法制備法舒地爾復(fù)乳。10 g 初乳組成為：以適量蓖麻油為油相，以法舒地爾水溶液為水相（其中含0.1 g 法舒地爾），以1.5 g 的Span 80與Tween 80 的混合物以及0.2 g 的TPGS 為混合乳化劑Ⅰ；復(fù)乳的組成為：采用上述制備的10 g 初乳為內(nèi)相，以8.3 g 水為外水相，以1.5 g 的Tween 80與磷脂的混合物以及0.2 g 的TPGS 為混合乳化劑Ⅱ。在控溫下將乳化劑Ⅰ及法舒地爾（0.1 g）溶于水中制備內(nèi)水相，于磁力攪拌器攪拌（8000 r/min）作用下將內(nèi)水相緩緩加入油相中（蓖麻油），充分?jǐn)嚢?5 min 得W/O 型初乳。將乳化劑Ⅱ溶解于水中制備外水相，隨后在1000 r/min 攪拌條件下，將W/O 型初乳緩緩加入到外水相中，攪拌20 min，得W/O/W 型復(fù)乳。

2.2.2 處方篩選 選取初乳中蓖麻油與蒸餾水的質(zhì)量比（A）、乳化劑I 中Span 80 與Tween 80 的質(zhì)量比（B）、乳化劑II 中Tween 80 與卵磷脂的質(zhì)量比（C）為考察因素，以離心保留率為評價指標(biāo)，每個因素各取3 個水平，采用L9（34）進(jìn)行正交實驗，因素水平見表1，正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表2、表3。

表1 正交因素水平表

表2 L9（34）正交試驗及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果表

根據(jù)方差分析結(jié)果顯示，A、B、C 三個因素中，A、B 對離心保留率有顯著影響，且影響順序為A＞B＞C，正交試驗中離心保留率最高的組合為A2B2C3。直觀分析結(jié)果，由極差R 可以發(fā)現(xiàn)對脂質(zhì)體包封率影響為A＞B＞C，得出最優(yōu)處方為A2B2C3，與正交分析優(yōu)選出的條件一致，為正交表中的實驗5，即蓖麻油與水質(zhì)量比為2∶1，乳化劑I 中Span 80 與Tween 80 質(zhì)量比為7∶3，乳化劑II 中Tween 80 與卵磷脂質(zhì)量比為4∶1。

2.3 法舒地爾復(fù)乳的制備

按照“2.2.2”項下所得最優(yōu)處方，稱取各成分，并按照“2.2.1”項下方法制備法舒地爾的復(fù)乳。具體為：在控溫下將乳化劑I（1.05 g Span 80、0.45 g Tween 80、0.2 g TPGS）及0.1 g 法舒地爾溶于2.73 g水中制備內(nèi)水相，于8000 r/min 攪拌作用下將內(nèi)水相緩緩加入5.47 g 蓖麻油中，充分?jǐn)嚢?5 min 得W/O 型初乳。將乳化劑Ⅱ（1.2 g Tween 80、0.3 g 卵磷脂、0.2 g TPGS）溶解于8.3 g 水中制備外水相，隨后在1000 r/min 攪拌條件下，將W/O 型初乳緩緩加入外水相中，攪拌20 min，得W/O/W 型復(fù)乳。

2.4 形態(tài)觀察

取少量復(fù)乳涂于載玻片，加少量水稀釋，涂勻后加蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，制備的法舒地爾復(fù)乳形態(tài)圓整、粒度均一。

2.5 粒度測定

圖2 法舒地爾復(fù)乳顯微形態(tài)觀察

使用馬爾文激光粒度儀測定法舒地爾復(fù)乳的粒徑。儀器的激光束波長設(shè)定為633 nm，入射光與散射光束的夾角為90°，測定溫度設(shè)定為25 ℃。取適量法舒地爾復(fù)乳經(jīng)20 倍量稀釋后進(jìn)行測定，測得復(fù)乳的粒徑分別為421.5 nm、345.1 nm、380.4 nm，平均粒徑為（382.3±38.2）nm。結(jié)果見圖3。

圖3 法舒地爾復(fù)乳粒徑圖

2.6 電導(dǎo)率測定

在室溫下，取適量法舒地爾復(fù)乳進(jìn)行電導(dǎo)率的測定，測得復(fù)乳的電導(dǎo)率為419 μs/cm、427 μs/cm、437 μs/cm，平均電導(dǎo)率為（428±9.02）μs/cm。

2.7 載藥量測定

稱3 批法舒地爾復(fù)乳，按照“2.1.2”項下操作制備供試品溶液，按照高效液相色譜法進(jìn)行含量檢測，測得法舒地爾復(fù)乳的載藥量分別為0.41%、0.54%、0.49%，平均載藥量為（0.48±0.06）%。

3 討 論

復(fù)乳的穩(wěn)定性是復(fù)乳處方篩選的重要指標(biāo)，而TPGS 藥物的作用除了作為乳化劑，還有提高穩(wěn)定性的作用，抑制胃腸道藥物外排泵P-gp 的作用［6-7］。因TPGS 的價格相對較高，在滿足需求的情況下TPGS 的使用量達(dá)到最低。TPGS 溶液的制備采用薄膜水化法，稱取0.20 g TPGS 置于梨形瓶中，加入10 mL 氯仿溶解，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋成膜，然后用相應(yīng)體積的蒸餾水溶解［8-9］。

混合乳化劑比單一乳化劑更能提高復(fù)乳穩(wěn)定性，Span 80 與Tween 80 乳化劑的結(jié)合能大大提高復(fù)乳的穩(wěn)定性［10］。復(fù)乳制備中，第二步乳化應(yīng)避免高速或長時間攪拌，否則油膜容易破裂，藥物包裹率會變低。