曾麗娜

【摘要】 目的：檢測7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮（DFOG）對H2O2 氧化應激人子宮螺旋動脈內(nèi)皮細胞（HUSAEC）增殖凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)HUSAEC細胞，在加入H2O2 氧化應激誘導前30 min，分別添加不同濃度DFOG（2、4、8 ?mol/L）進行預孵，MTT檢測DFOG對H2O2 氧化應激誘導的HUSAEC細胞的增殖促進作用，F(xiàn)CM檢測DFOG對H2O2 氧化應激誘導的HUSAEC細胞凋亡情況。結果：與H2O2組比較，DFOG各組明顯減輕了H2O2對HUSAEC細胞增殖的抑制作用，減少H2O2氧化應激誘導HUSAEC細胞的凋亡（P<0.05），呈濃度和時間依賴性。結論：DFOG對H2O2 氧化應激HUSAEC細胞有明顯的促進增殖及抑制凋亡作用，提示DFOG可能成為妊娠期高血壓疾病治療的新型藥物。

【關鍵詞】 妊娠期高血壓疾病 7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮 增殖 凋亡

Effects of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy Genistein on Endothelial Cells of Human Uterine Spiral Artery Induced by Oxidative Stress/ZENG Lina. //Medical Innovation of China， 2020， 17（10）： -160

[Abstract] Objective： To determine the effect of 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein （DFOG） on proliferation and apoptosis of human uterine spiral artery endothelial cells （HUSAEC） induced by H2O2 oxidative stress. Method： HUSAEC cells were cultured in vitro， 30 minutes before the induction of H2O2 oxidative stress， different concentrations of DFOG （2， 4， 8 μmol/L） were added for pre incubation. MTT was used to detect the effect of DFOG on the proliferation of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress， FCM was used to detect the effect of DFOG on the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress. Result： Compared with H2O2 group， DFOG group significantly reduced the inhibition of H2O2 on the proliferation of HUSAEC cells， and reduced the apoptosis of HUSAEC cells induced by H2O2 oxidative stress （P<0.05）， which was concentration and time-dependent. Conclusion： DFOG can significantly promote proliferation and inhibit apoptosis of H2O2 oxidative stress HUSAEC cells， suggesting that DFOG may be a new drug for the treatment of hypertension during pregnancy.

[Key words] Hypertension during pregnancy 7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein Proliferation Apoptosis

First-authors address： The Affiliated Hospital of Putian University， Putian 351100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.10.039

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorders complicating pregnancy， HDCP）是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，發(fā)生率5%～12%，是一組嚴重影響母嬰健康的疾病，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因[1]。目前HDCP病因學主要集中在子宮螺旋小動脈重鑄不足、炎癥免疫過度激活、血管內(nèi)皮受損、遺傳因素、營養(yǎng)缺乏、胰島素抵抗等方面，其中子宮螺旋小動脈內(nèi)皮損傷是研究HDCP的熱點之一[2]。血管內(nèi)皮細胞損傷是子癇前期的基本病理變化，可使擴血管物質，如一氧化氮、前列環(huán)素I2合成減少，而縮血管物質如內(nèi)皮素、血栓素A2等合成增加，從而促進血管痙攣;另外血管內(nèi)皮細胞損傷還可以激活血小板和凝血因子，加重子癇前期高凝狀態(tài)[3]。引起子癇前期血管內(nèi)皮損傷的因素很多，主要為氧化應激反應產(chǎn)生的炎性介質，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、極低密度脂蛋白等[4]。研究表明氧化應激在子癇前期的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，H2O2是活性氧家族中重要的一員，可以體外誘導細胞凋亡;紫外線等離子射線作用于細胞后，可誘使細胞產(chǎn)生H2O2，進而誘導細胞發(fā)生凋亡[5]。7-二氟亞甲基-5，4-二甲氧基染料木黃酮（7-difluoromethy-5，4-dimethoxy genistein， DFOG）是一種從豆類植物提取的異黃酮化合物衍生物，具有抗氧化、抑凋亡、抗腫瘤以及類雌激素等作用[6-7]。2018年5月-2019年4月本研究擬探討DFOG對體外培養(yǎng)H2O2氧化應激損傷的人子宮螺旋動脈內(nèi)皮細胞（HUSAEC）的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HUSAEC購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心;DFOG由湖南師范大學醫(yī)學院藥學系合成;H2O2（恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）;DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）;MTT（美國Sigma公司）;二甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 HUSAEC用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞貼壁生長后，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。根據(jù)受試物的不同分為A、B、C、D、E組，A組為正常對照組（受試物為NS）;B組受試物H2O2（H2O2終濃度為1 mmol/L）;C、D、E各組在加入1 mmol/L H2O2前30 min，分別添加DFOG進行預孵，使DFOG終濃度分別為2、4、8 ?mol/L。即：C組受試物為DFOG 2 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;D組受試物為DFOG 4 ?mol/L+1 mmol/L H2O2;E組受試物為DFOG 8 ?mol/L+1 mmol/L H2O2。

1.2.2 MTT測定HUSAEC細胞生長增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的HUSAEC細胞，分別加入A、B、C、D、E組受試物，5組均予以培養(yǎng)24、48和72 h，改用5 mg/L MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移去MTT混懸液，再用100 ?L DMSO溶解晶體，用酶標儀（ELX-800）570 nm波段檢測吸光度值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=（1-實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值）×100%，采用改良寇氏法求出IC50值[8]。以上實驗重復3次。

1.2.3 PI染色流式細胞術檢測HUSAEC細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的HUSAEC細胞，分別加入A、B、C、D、E組受試物，5組均予以培養(yǎng)48 h，收集細胞，用冰PBS洗2遍，用4 ℃的70%的乙醇固定24 h后，碘化丙啶4 ℃避光染色，流式細胞儀檢測不同受試物作用下HUSAEC細胞凋亡率[9]。以上實驗重復3次。

1.3 觀察指標 （1）分析DFOG對氧化應激誘導的HUSAEC細胞生長增殖活性的影響;（2）分析DFOG對氧化應激誘導的HUSAEC細胞凋亡的影響。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間均數(shù)比較，采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，多組間均數(shù)組間兩兩比較采用SNK法（q檢驗）進行單因素方差分析;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DFOG對氧化應激誘導的HUSAEC細胞生長增殖活性的影響 B組HUSAEC細胞24、48、

72 h細胞增殖活性分別為（87.51±2.93）%、（70.24±3.79）%和（41.39±5.26）%，表明H2O2可以抑制細胞的生長增殖。C組HUSAEC細胞24、48、72 h細胞增殖活性分別為（94.30±2.04）%、（81.09±3.25）%和（75.57±3.52）%;D組HUSAEC細胞24、48、72 h細胞增殖活性分別為（96.21±1.87）%、（84.73±2.98）%和（80.94±3.39）%;E組HUSAEC細胞24、48、72 h細胞增殖活性分別為（97.12±1.63）%、（88.31±2.87）%和（84.53±3.12）%。隨著DFOG濃度的增加以及培養(yǎng)時間的延長，逐漸改善H2O2氧化應激誘導HUSAEC細胞的增殖抑制，其中E組改善效果最明顯。24、48、72 h，C、D、E組的細胞增殖活性均高于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

圖1 DFOG對氧化應激誘導的HUSAEC細胞生長增殖活性的影響

2.2 DFOG對氧化應激誘導的HUSAEC細胞凋亡的影響 48 h后，A、B、C、D、E組細胞凋亡率分別為（4.96±2.17）%、（51.64±3.50）%、（42.33±5.16）%、（31.68±4.90）%、（20.44±3.19）%，C、D、E組的細胞凋亡率均低于B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;C、D、E各組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示作用呈濃度依賴性。見圖2。

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于各種植物中，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，通過與靶蛋白的結合，對細胞凋亡進行調(diào)節(jié)，是其機制之一，有研究表明，黃酮類化合物可以調(diào)節(jié)動靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，促進細胞增殖，預防內(nèi)皮細胞損傷[10-11]。染料木黃酮又名金雀異黃素、染料木苷元，化學名為4，5，7-三羥基異黃酮，分子式為C15H10O5（相對分子量為270.2 g/mol），是大豆異黃酮的主要成分。以染色木黃酮為先導化合物，在C-7位引入二氟亞甲基、C-5，4位引入甲氧基，定向化學改造得到的DFOG具有更強的拮抗血管內(nèi)皮細胞氧化應激損傷的活性[12]。因此，本實驗通過體外培養(yǎng)H2O2氧化應激損傷的HUSAEC細胞，觀察DFOG對HUSAEC細胞的增殖抑制活性及細胞凋亡效用，并進一步探討其可能的分子生物學機制。

Marinova等[13]研究表明DFOG體外通過調(diào)節(jié)神經(jīng)蛋白而對神經(jīng)母細胞瘤U0126細胞有增殖抑制的作用，而對正常神經(jīng)細胞無毒性或毒性很小。Hernández等[14]研究表明DFOG通過調(diào)節(jié)5-HI的表達，增強腦細胞抗氧化作用，提高阿爾茨海默病的臨床效果。徐叢榮等[15]采用MTT比色法觀察到染料木黃酮能明顯抑制體外培養(yǎng)的宮頸Hela細胞的增殖，對宮頸癌Hela細胞的生長抑制作用具有劑量依賴性，隨著染料木黃酮藥物濃度的增大，其對Hela細胞的增殖抑制作用也逐漸增強。2019年姜雪梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮通過抑制ERK及JNK的活化從而抑制人非小細胞肺癌PC14細胞的增殖。目前DFOG對HUSAEC氧化應激損傷作用方面的文獻報道較少。胎盤滋養(yǎng)細胞是胎盤的主要細胞類型之一，滋養(yǎng)細胞的功能障礙可以導致活性氮和活性氧的產(chǎn)生，進而激活母體血管內(nèi)皮細胞，引起子癇前期相關的多系統(tǒng)功能障礙[17]。子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細胞活性下降，其中子癇前期胎盤滋養(yǎng)層谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽氧化還原比（GRR）和總抗氧化能力（TAC）水平明顯降低，染料木黃酮孵育子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細胞后，GPx、GRR和TAC水平明顯升高，提示染料木黃酮可以改善子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細胞的氧化應激水平[17]。本研究通過體外培養(yǎng)H2O2氧化應激誘導的HUSAEC細胞，驗證DFOG可以改善氧化應激誘導損傷的HUSAEC細胞生長，降低細胞凋亡率。文獻[18-19]報道DFOG對氧化誘導的血管內(nèi)皮細胞與單核細胞黏附及黏附分子E選擇素、細胞間黏附分子1的釋放有明顯抑制作用，其作用機制可能與下調(diào)核因子κB和磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2的表達有關;DFOG對H2O2誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡有明顯的抑制作用，其作用機制可能是通過降低活性氧的生成，下調(diào)Caspase-3的表達，從而拮抗H2O2誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡。

綜上所述，DFOG對H2O2誘導氧化應激損傷的HUSAEC細胞有明顯的促進增殖及抑制凋亡作用，本課題組將進一步研究其可能的分子生物學機制，為HDCP的治療提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

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（收稿日期：2019-08-28） （本文編輯：姬思雨）