胡海林，羅 敏

目的：探討高糖環(huán)境下外源性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)功能的影響及其機(jī)制。

方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為對(duì)照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L)、低糖組(葡萄糖濃度5mmol/L)、高糖組(葡萄糖濃度30mmol/L)，分別加入CXCL9(100ng/mL)、CXCL10(10ng/mL)、CXCL11(100ng/mL)，培養(yǎng)24、48、72h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，RT-PCR檢測(cè)CXCR3 mRNA的表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志分子Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況。

結(jié)果：CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，加入三種外源性趨化因子后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞吸光度值逐漸增強(qiáng)；低糖組細(xì)胞吸光度值呈現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)到高峰；高糖組細(xì)胞吸光度值總體呈降低趨勢(shì)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，加入三種外源性趨化因子后48、72h，低糖組和高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且均較同組24h時(shí)升高。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，加入三種外源性趨化因子后72h，低糖組與高糖組細(xì)胞Ki-67熒光強(qiáng)度降低，高糖組變化更明顯。

結(jié)論：高糖環(huán)境下外源性加入CXCL9、CXCL10、CXCL11可使HUVEC細(xì)胞活力下降并誘導(dǎo)CXCR3表達(dá)增強(qiáng)，且以外源性加入CXCL10、CXCL11配體后，CXCR3表達(dá)增幅最高，這可能成為臨床干預(yù)糖尿病視網(wǎng)膜病變的靶點(diǎn)。

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者眼部最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，是世界范圍內(nèi)主要的致盲性眼病[1-2]。DR患者表現(xiàn)為視力模糊，眼前有暗點(diǎn)或閃爍的燈光以及視力喪失，眼底檢查表現(xiàn)為微血管瘤、出血、滲出、視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、靜脈串珠樣改變、新生血管等。糖尿病患者由于高血糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，氧化酶損傷，微血栓形成，細(xì)胞黏附分子活化，白細(xì)胞淤積和細(xì)胞因子活化，繼之缺氧調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)因子表達(dá)增加和細(xì)胞因子產(chǎn)生導(dǎo)致微循環(huán)障礙。DR的發(fā)病機(jī)制包括異常代謝途徑、氧化應(yīng)激和慢性炎癥等學(xué)說(shuō)[3-4]。近年來(lái)，慢性炎癥學(xué)說(shuō)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。靶向抗炎治療，如抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)藥物玻璃體腔注射等，可以在一定程度上延緩DR的發(fā)展[4-5]。

白細(xì)胞在視網(wǎng)膜微血管的黏附可能是激活DR復(fù)雜病理過(guò)程的起始途徑，趨化因子參與了這一過(guò)程。趨化因子是細(xì)胞因子超家族中的一種由70～80個(gè)氨基酸組成，對(duì)白細(xì)胞等細(xì)胞具有趨化作用的小分子蛋白質(zhì)[6]。γ-干擾素誘導(dǎo)的單核因子(CXCL9)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(CXCL10)、干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α化學(xué)引誘劑(CXCL11)是趨化因子CXCR3的3個(gè)配體[7-8]。CXCR3是表達(dá)在T細(xì)胞表面的趨化因子受體，能誘導(dǎo)趨化、細(xì)胞遷徙和黏附。臨床研究表明，CXCR3在臨床監(jiān)測(cè)DR病情嚴(yán)重程度上具有一定價(jià)值[9]。動(dòng)物研究也表明，CXCR3族趨化因子參與了DR的病程變化[10]。然而，CXCR3的3個(gè)配體在DR發(fā)展過(guò)程中所起的作用不明。因此，本研究從細(xì)胞學(xué)角度研究CXCR3的3個(gè)配體與DR病情之間的關(guān)聯(lián)，以便為尋找治療DR的靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)(上海細(xì)胞生物研究所)；DMEM(Gibco，美國(guó))，抗生素(青-鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，CXCL9、CXCL10、CXCL11(Bioleng，美國(guó))，CXCR3抗體(Abcam，美國(guó))，CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(同仁公司，日本)，鼠抗Ki67單克隆抗體、Alexa Fluor 488羊抗鼠二抗、SYBR green one Real-time PCR試劑盒(TaKaRa，日本)，Trizol試劑盒(Life technology，美國(guó))。

1.1.2主要儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermal，美國(guó))，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，程序降溫凍存盒(Nalgene，美國(guó))，-80℃低溫冰箱(SANYO，日本)，JB90-1定時(shí)磁力攪拌器(上海衡平儀器廠)，PHS-2C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)，旋渦混合器MAXIMIX plus TM (Thermolyne，美國(guó))，臺(tái)式低溫離心機(jī)(Beckman Coulter，法國(guó))，電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械五廠)，高速離心機(jī)(Beckman Coulter，美國(guó))，精密天平BS110S(Sartorius，德國(guó))，電泳儀及電轉(zhuǎn)儀Mini Protein Ⅱ型(Bio-Rad，美國(guó))，制冰機(jī)F-120C-50型(HOSHIZAKI，日本)，Envsion全波段酶標(biāo)檢測(cè)儀(PE，美國(guó))，電泳系統(tǒng)(電泳儀、電泳槽等)，Bio-Rad GelDoc 2000成像系統(tǒng)，Stratagene Mxp3000熒光PCR儀。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HUVEC置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，1～2d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞融合率達(dá)到90%～95%后按1∶3以上的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，約2～3d消化傳代一次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為對(duì)照組(葡萄糖濃度5.5mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng))、低糖組(葡萄糖濃度5mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng))、高糖組(葡萄糖濃度30mmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將HUVEC細(xì)胞接種至96孔板，每孔5000個(gè)細(xì)胞(200μL相應(yīng)的培養(yǎng)基)，分別加入趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，終濃度分別為100、10、100ng/mL。培養(yǎng)24、48、72h，向待測(cè)孔中加入20μL CCK-8試劑孵育2h后，在酶標(biāo)檢測(cè)儀450nm下檢測(cè)吸光度值(OD)。檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)CXCR3 mRNA的表達(dá) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將HUVEC細(xì)胞接種至6孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，分別加入趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，終濃度分別為100、10、100ng/mL。培養(yǎng)24、48、72h。利用Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，進(jìn)行濃度檢測(cè)后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR green 法對(duì)CXCR3進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，管家基因GAPDH作為內(nèi)參，以2-△△Ct值計(jì)算CXCR3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。CXCR3正向引物5’-CCACCTAGCTGTAGCAGACAC-3’，反向引物5’-AGGGCTCCTGCGTAGAAGTT-3’。GAPDH正向引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.4免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志分子Ki67含量 將HUVEC細(xì)胞接種至放置爬片的6孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，孵育24h，換不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基并分別加入趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11，終濃度分別為100、10、100ng/mL。72h后，去除培養(yǎng)基，PBS漂洗3次。用4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗3次，10%驢血清封閉30min；加入鼠抗Ki67單克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜；次日用PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 488羊抗鼠二抗室溫避光孵育2h，隨后漂洗3次，10min/次，加入DAPI染色20min，PBS沖掉染色液后用濾紙吸干，封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。以細(xì)胞核出現(xiàn)綠色熒光為Ki67陽(yáng)性染色，計(jì)數(shù)每視野熒光細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算熒光細(xì)胞百分比。

2 結(jié)果

2.1外源性趨化因子對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，加入外源性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞吸光度值逐漸增強(qiáng)；低糖組細(xì)胞吸光度值呈現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)到高峰；高糖組細(xì)胞吸光度值總體呈降低趨勢(shì)(表1)。加入三種趨化因子后24h，三組細(xì)胞吸光度值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；加入三種趨化因子后48h，高糖組與對(duì)照組細(xì)胞吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且加入CXCL11時(shí)低糖組與對(duì)照組細(xì)胞吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；加入三種趨化因子后72h后，低糖組和高糖組細(xì)胞吸光度值分別與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且加入CXCL10時(shí)低糖組與高糖組細(xì)胞吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

趨化因子組別培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h培養(yǎng)72hCXCL9對(duì)照組0.42±0.050.88±0.161.09±0.17低糖組0.40±0.100.60±0.120.55±0.12高糖組0.45±0.060.38±0.070.26±0.09P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.7720.1930.008P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.5420.0230.001P(低糖組 vs 高糖組)0.4990.4300.115CXCL10對(duì)照組0.38±0.100.89±0.181.07±0.16低糖組0.41±0.080.61±0.140.57±0.11高糖組0.42±0.110.35±0.130.23±0.08P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.7060.1890.007P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.6650.014<0.001P(低糖組 vs 高糖組)0.9050.2450.042CXCL11對(duì)照組0.50±0.130.96±0.091.11±0.13低糖組0.44±0.060.56±0.110.55±0.11高糖組0.41±0.100.43±0.160.25±0.08P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.5080.0220.003P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.3960.006<0.001P(低糖組 vs 高糖組)0.6790.7660.056

注：CXCL9：F時(shí)間=11.14，P時(shí)間=0.002；F組間=15.18，P組間=0.004；F組間×?xí)r間=12.51，P組間×?xí)r間<0.001。CXCL10：F時(shí)間=11.46，P時(shí)間=0.002；F組間=19.38，P組間=0.002；F組間×?xí)r間=12.35，P組間×?xí)r間<0.001。CXCL11：F時(shí)間=13.13，P時(shí)間=0.001；F組間=29.95，P組間=0.001；F組間×?xí)r間=13.61，P組間×?xí)r間<0.001。

趨化因子組別培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h培養(yǎng)72hCXCL9對(duì)照組1.01±0.201.07±0.191.04±0.18低糖組3.20±1.204.20±0.804.37±0.51高糖組4.46±0.955.40±0.675.30±0.51P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.0710.002<0.001P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.009<0.001<0.001P(低糖組 vs 高糖組)0.3980.1570.019CXCL10對(duì)照組1.05±0.211.00±0.201.01±0.19低糖組3.20±1.084.60±0.804.33±0.51高糖組4.80±1.306.10±0.406.00±1.11P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.1080.0100.004P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.0100.002<0.001P(低糖組 vs 高糖組)0.2800.2910.036CXCL11對(duì)照組0.98±0.210.98±0.181.02±0.23低糖組3.14±1.153.73±1.124.06±0.39高糖組4.33±0.765.67±0.725.50±0.49P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.0510.015<0.001P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.0070.001<0.001P(低糖組 vs 高糖組)0.3640.0660.003

注：CXCL9：F時(shí)間=19.41，P時(shí)間<0.001；F組間=35.42，P組間<0.001；F組間×?xí)r間=4.48，P組間×?xí)r間=0.019。CXCL10：F時(shí)間=45.12，P時(shí)間<0.001；F組間=23.22，P組間=0.001；F組間×?xí)r間=13.74，P組間×?xí)r間<0.001。CXCL11：F時(shí)間=12.26，P時(shí)間=0.001；F組間=38.8，P組間<0.001；F組間×?xí)r間=3.71，P組間×?xí)r間=0.034。

2.2外源性趨化因子對(duì)HUVEC細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，外源性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11加入48、72h后，低糖組和高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平高于24h(表2)。加入外源性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后 24h，高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平比對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；加入三種趨化因子后48h，低糖組、高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；加入三種趨化因子后72h后，低糖組、高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組，低糖組和高糖組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 加入外源性趨化因子后72h Ki-67免疫熒光顯色圖(×40) A：加入CXCL9；B：加入CXCL10；C：加入CXCL11。

組別CXCL9CXCL10CXCL11對(duì)照組37.0±5.244.2±4.140.7±4.6低糖組20.7±4.516.7±4.324.5±3.5高糖組16.8±2.516.2±2.615.2±4.9 P(對(duì)照組 vs 低糖組)0.0150.0010.008P(對(duì)照組 vs 高糖組)0.0040.0010.003P(低糖組 vs 高糖組)0.2600.8720.056

注：FCXCL9=19.302，PCXCL9=0.002；FCXCL10=54.939，PCXCL10<0.001；FCXCL11=26.102，PCXCL11=0.001。

2.3外源性趨化因子對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖標(biāo)志分子Ki67表達(dá)的影響 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，加入外源性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11后72h，與對(duì)照組相比，低糖組與高糖組細(xì)胞Ki-67熒光強(qiáng)度降低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高糖組降低更明顯(圖1，表3)。

3 討論

隨著糖尿病患病人數(shù)的增多，DR的發(fā)病率也越來(lái)越高[11]。有研究人員在2017年對(duì)我國(guó)山東等省糖尿病患者進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DR發(fā)病率高達(dá)34.08%[12]。隨著DR病情的進(jìn)展，可造成不可逆的視力損害，對(duì)視覺(jué)健康造成巨大的影響，因此找到DR的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要[13]。研究表明，DR是一種高血糖引起的視網(wǎng)膜慢性低度炎癥性疾病[14]。動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，CXCR3參與這一炎癥反應(yīng)過(guò)程，但其配體CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCR3結(jié)合后在DR發(fā)展過(guò)程中所起的作用不明，本研究從細(xì)胞學(xué)角度研究CXCR3的3個(gè)配體與DR病情之間的關(guān)聯(lián)，從而為發(fā)現(xiàn)DR治療的靶點(diǎn)提供一定的依據(jù)。

有研究認(rèn)為，CXCL9通過(guò)與相應(yīng)受體相互作用，活化各類(lèi)白細(xì)胞并趨化至病灶處，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的遷移，在炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用[15]。CXCL10對(duì)于T細(xì)胞的發(fā)育、遷移、黏附起著重要作用，還能夠活化單核細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，參與多種自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[16]。 CXCL11和受體結(jié)合后，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞遷移，產(chǎn)生促炎作用，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)，調(diào)控血管生成等[17]。

本研究中，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在加入三種外源性趨化因子后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞吸光度值逐漸增強(qiáng)，低糖組48h達(dá)到高峰，72h又呈下降趨勢(shì)，而高糖組除加入CXCL11 48h時(shí)略有增長(zhǎng)外，總體呈降低趨勢(shì)。該結(jié)果表明高糖環(huán)境下，加入三種外源性趨化因子后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞活力下降，這與既往研究結(jié)果一致[18]。此外，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，加入三種外源性趨化因子后，低糖組和高糖組細(xì)胞CXCR3 mRNA較對(duì)照組均出現(xiàn)增高的趨勢(shì)，且在48、72h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示三種外源性趨化因子和CXCR3的作用存在一定的時(shí)間性。高糖環(huán)境下，三種外源性趨化因子與CXCR3作用引起其表達(dá)下降拐點(diǎn)出現(xiàn)在48h，分析早期高糖環(huán)境下趨化因子能招募免疫細(xì)胞(如Th1細(xì)胞)，發(fā)揮抑制血管新生作用[19]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于CXCL9、CXCL10及CXCL11與DR的相關(guān)報(bào)道較少，推測(cè)可能是該三種外源性趨化因子有不同的調(diào)控機(jī)制，其表達(dá)有不同的時(shí)間性和空間性，在不同的條件下有不同的優(yōu)勢(shì)因子，所以該三種趨化因子與DR及其臨床表現(xiàn)的相關(guān)性并不完全一致。

綜上，本研究表明，高糖環(huán)境下外源性加入CXCL9、CXCL10、CXCL11可使HUVEC細(xì)胞活力下降并誘導(dǎo)CXCR3表達(dá)增強(qiáng)，且以外源性加入CXCL10、CXCL11配體后，CXCR3表達(dá)增幅最高，這可能成為臨床干預(yù)糖尿病視網(wǎng)膜病變的靶點(diǎn)。