馬濟遠，葉 巍，李 吉，裴 瑞，何夢梅，蘇靜波，孫董潔，周其武，周 健

目的：探究自噬水平變化對高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其機制。

方法：人晶狀體上皮細胞(HLE-B3)分為正常對照組(NC組)和高糖處理組(HG組)，分別用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培養(yǎng)12、24、48h，用Western blot檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬標志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表達變化，用劃痕實驗觀察細胞的移行能力以明確高糖對晶狀體上皮細胞自噬和EMT的影響。利用雷帕霉素調(diào)節(jié)自噬水平，將細胞分為正常對照組(NC組)、高糖處理組(HG組)，高糖處理細胞的同時添加DMSO溶劑組(DMSO組)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素組(RAPA組)，處理細胞24h，用Transwell實驗觀察細胞的移行能力，用Western blot檢測EMT、自噬標志蛋白和TGF-β信號通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表達。用細胞免疫熒光染色觀察SQSTM1/p62與Smad2/3在細胞內(nèi)的表達，免疫共沉淀方法檢測細胞中SQSTM1/p62與Smad2/3之間的相互結(jié)合。

結(jié)果：在高糖刺激后12、24、48h，HG組細胞E-cadherin、LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達逐漸降低(F=67.52、163、206，均P<0.0001)，而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表達增加(F=53.37、302.1，均P<0.0001)，細胞移行也較NC組增加(均P<0.001)，提示高糖刺激后細胞發(fā)生EMT，而自噬水平降低；雷帕霉素處理后，與HG組和DMSO組相比，RAPA組LC3 Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表達水平增加，α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表達降低(均P<0.05)，TGF-β2表達無明顯改變(均P>0.05)，細胞移行被抑制(均P<0.001)，提示雷帕霉素在提高自噬水平的同時下調(diào)了TGF-β信號通路分子的表達進而抑制了EMT。細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示SQSTM1/p62與Smad2/3在胞漿內(nèi)存在共定位，免疫共沉淀實驗證實了SQSTM1/p62與Smad2/3蛋白相互結(jié)合。

結(jié)論：高糖可刺激HLE-B3細胞發(fā)生EMT，下調(diào)細胞的自噬水平；自噬通過SQSTM1/p62與Smad2/3相互作用，改變了TGF-β信號通路中Smad2/3的表達，實現(xiàn)對EMT的調(diào)節(jié)。

0 引言

白內(nèi)障是糖尿病患者的眼部常見并發(fā)癥之一，其患白內(nèi)障的風(fēng)險是普通人的2～5倍，且發(fā)生的年齡更早[1]、原因復(fù)雜，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在糖尿病白內(nèi)障的形成中起了重要作用[2-4]。自噬(autophagy)是一種維持細胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)和促進細胞存活的基本細胞降解機制[5]。越來越多的研究表明自噬與EMT之間密切相關(guān)[6]，一方面，細胞依賴自噬激活后發(fā)生EMT而在受到外界刺激后得以存活，如在心肌細胞H9c2缺氧/復(fù)氧模型中發(fā)現(xiàn)高遷移率族1蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)通過增加盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)的表達和抑制由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化激活的自噬而誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT[7]；與此相反，另一方面自噬還有抑制腫瘤信號的作用，這阻礙了EMT過程，如沉默自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和ATG7的表達可使膠質(zhì)母細胞瘤細胞中調(diào)節(jié)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達增高，從而增強這種細胞的EMT過程；然而，當用饑餓和mTOR抑制劑激活細胞自噬時，細胞遷移和侵襲能力卻減弱[8]。

目前，對高濃度葡萄糖(簡稱高糖)刺激后人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cell，HLEC)中自噬水平的變化情況，以及干預(yù)自噬后對EMT影響的相關(guān)研究還少有報道。本研究觀察了高糖環(huán)境下人晶狀體上皮細胞的自噬和EMT水平的變化，并觀察用自噬激動劑雷帕霉素改變自噬水平后對晶狀體上皮細胞EMT的影響，探討自噬對EMT的調(diào)節(jié)作用及機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞 永生化人晶狀體上皮細胞系HLE-B3獲自北京眼科研究所張偉教授饋贈。HLE-B3細胞交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行細胞系短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)鑒定，結(jié)果與收錄在DSMZ數(shù)據(jù)庫的SRA01/04細胞系完全匹配，SRA01/04細胞系為人類晶狀體上皮細胞系，結(jié)果可證明本研究所用HLE-B3細胞為晶狀體上皮細胞。

1.1.2試劑 雷帕霉素(rapamycin)購自美國Med Chem Express公司；蛋白酶抑制劑(No.539131)、磷酸酶抑制劑(No.524629)以及TGF-β2抗體(No.AEB586)均購自美國EMD Millipore公司；LC3(No.12741)、E-cadherin(No.14472)、Smad2/3(No.8685)、p-Smad2(No.3108)、p-Smad3(No.9520)以及Snail(No.3879)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；α-SMA(No.ab5694)、SQSTM1/p62(No.ab56416)以及Beclin 1(No.ab62557)抗體均購自美國Abcam公司；GAPDH(No.60004-1-Ig)抗體、HRP標記山羊抗兔IgG抗體以及HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體均購自中國武漢三鷹公司；Alexa Fluor 594標記的驢抗兔IgG抗體和Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG抗體均購自上海翊圣生物科技有限公司；含DAPI的抗熒光淬滅封片劑購自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒以及IP裂解液均購自中國上海碧云天公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自中國北京ZETA公司；protein A/G磁珠購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.3儀器設(shè)備 Transwell小室(Millipore公司，美國)，SDS-PAGE電泳儀、電泳槽及化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad公司，美國)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 HLE-B3細胞培養(yǎng)在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的低濃度葡萄糖(5.5mmol/L)杜氏培養(yǎng)基(DMEM)中，并置于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每2d更換1次培養(yǎng)基，細胞達到80%～90%融合度后進行傳代。在細胞長至密度約為70%后，轉(zhuǎn)移至無血清培養(yǎng)基中饑餓2h后，高糖處理組(HG組)細胞更換添加了30mmol/L葡萄糖的DMEM(總葡萄糖濃度35.5mmol/L)中培養(yǎng)，而正常對照組(NC組)細胞仍用上述低濃度葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在高糖處理前(0h)、處理后12、24、48h 觀察自噬和EMT相關(guān)指標。在200nmol/L雷帕霉素干預(yù)高糖處理的HLE-B3細胞實驗中，將細胞分為4組，在原有的NC組和HG組基礎(chǔ)上，增加雷帕霉素組(RAPA組)和溶劑組(DMSO組)，即在高糖處理細胞的同時，用200nmol/L雷帕霉素和其等量的溶劑DMSO分別處理細胞24h，并觀察相關(guān)指標。

1.2.2 Western blot實驗 經(jīng)過處理的HLE-B3細胞，在棄去培養(yǎng)液之后用PBS清洗3遍，再加入1mL PBS并使用細胞刮刀刮取細胞，將含有細胞的PBS轉(zhuǎn)移至EP管中，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄去上清液后加入配置好的含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液120μL，經(jīng)過充分裂解和超聲粉碎后于4℃、12000r/min離心15min，吸取上清液。取20μL蛋白樣品用BCA法測定蛋白濃度。在剩余的100μL蛋白提取液中加入25μL 5×上樣緩沖液，于100℃金屬浴中加熱10min，冷卻到室溫。向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，根據(jù)測定的蛋白濃度從每個樣本取30μg蛋白，上樣到配置好的8%或15%的SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，在Bio-Rad標準電泳裝置上進行電泳蛋白分離，再將分離的蛋白使用Bio-Rad標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置冰浴下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。剩余的變性后蛋白置于-20℃冰箱中保存。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜3h，4℃下孵育相應(yīng)的一抗(稀釋濃度均為1∶1000)過夜。TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。再使用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋濃度均為1∶3000)37℃孵育1h，TBST漂洗PVDF膜3次，每次5min。配置化學(xué)發(fā)光顯色液(A液∶B液=1∶1)，在Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀下進行化學(xué)發(fā)光顯影，并獲得圖像。使用Image J軟件對相應(yīng)條帶灰度值進行測量。

1.2.3劃痕實驗 將細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，確保過夜后細胞100%融合。次日使用1mL移液槍槍頭在6孔板內(nèi)筆直劃線，形成一條劃痕(原始劃痕)，然后用PBS清洗3次，洗去脫落的細胞。將劃痕處理后的細胞分別置于常規(guī)DMEM培養(yǎng)基(NC組)和含高糖的DMEM培養(yǎng)基(HG組)中培養(yǎng)，分別在0、12、24、48h于倒置顯微鏡下觀察并拍照劃痕(新劃痕)變化情況，每組隨機挑選3個視野。用Image J軟件標記圖片中劃痕范圍并計算劃痕的面積。細胞遷移百分比(%)=(原始劃痕面積-新的劃痕面積)/原始劃痕面積×100%。

1.2.4 Transwell實驗 將200μL HLE-B3細胞懸液接種于Transwell小室的上室(1×104/孔)，下室根據(jù)分組(NC組、HG組、DMSO組、RAPA組)分別添加相應(yīng)的培養(yǎng)基500μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將小室置于4%多聚甲醛中固定0.5h，小心拭去上室細胞，將小室用結(jié)晶紫染色15min。用PBS洗3次后在倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)量，隨機取5個視野拍照并計數(shù)。

1.2.5 細胞免疫熒光染色 將正常培養(yǎng)的HLE-B3細胞接種于放置細胞爬片的12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h，待細胞長至70%時，吸除培養(yǎng)基，加入PBS浸洗細胞3次，每次5min。向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1mL固定細胞30min后，吸去多聚甲醛，用PBS洗3次，每次5min。然后向孔內(nèi)加入含有1% Tritonx-100和1% BSA的PBS室溫放置2h后吸去孔內(nèi)液體，加入Smad2/3和SQSTM1/p62一抗稀釋液(稀釋濃度均為1∶100)4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。次日先吸去一抗稀釋液，用PBS漂洗3次，每次5min，再滴加Alexa Fluor 594標記的驢抗兔IgG抗體(1∶100)和Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG抗體(1∶100)，在室溫下避光孵育2h后用PBS洗3次，每次5min。將含DAPI(0.4μg/mL)的封片劑滴于載玻片上，取出細胞爬片，將有細胞面向著載玻片方向貼于載玻片上。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.2.6免疫共沉淀實驗 經(jīng)過分組處理后的HLE-B3細胞，在棄去培養(yǎng)液后用PBS清洗3遍，加入1mL PBS，使用細胞刮刀刮取細胞，將含有細胞的PBS轉(zhuǎn)移至EP管中，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄去上清后加入含蛋白酶抑制劑的IP裂解液1mL，輕輕吹懸后置于4℃裂解1h。在12000r/min下離心30min后取上清液，取20μL用于BCA蛋白定量，取50μL加入2×上樣緩沖液50μL，100℃金屬浴中加熱10min作為Input樣品。在其余細胞裂解液加入5μL p62抗體，4℃搖床上緩慢搖晃過夜。在上述混合液中加入protein A/G磁珠20μL，經(jīng)孵育4h后將樣品置于磁力架輕輕顛倒10次，此時含有IP的分子及其結(jié)合的蛋白的磁珠被吸附在EP管壁上。棄去上清液，再加入IP裂解液輕輕顛倒10次，重復(fù)3遍，棄去上清，在含磁珠的EP管中加入2×上樣緩沖液50μL，充分震蕩混勻后于100℃金屬浴中加熱10min，即為IP樣品。根據(jù)測定的蛋白濃度從每個Input樣品中取30μg蛋白上樣，根據(jù)一次Western blot預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整正式IP時的上樣量，保證每個組免疫沉淀物中的SQSTM1/p62的量基本一致。

2 結(jié)果

2.1高糖促進晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT Western blot結(jié)果顯示，隨著高糖刺激時間(0～48h)的延長，HLE-B3細胞的上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達量逐漸降低(F=67.52，P<0.0001)，而間充質(zhì)細胞標志蛋白α-SMA表達量逐漸升高(F=53.37，P<0.0001)，而且各時間點與高糖處理前(0h)相比，E-cadherin和α-SMA表達量均有顯著性差異(P12h=0.015、0.033；P24h=0.0003、0.0006；均P48h<0.0001；圖1A～C，表1)。同時，劃痕實驗結(jié)果顯示，高糖處理12、24、48h時，劃痕面積較NC組明顯縮小，HG組細胞遷移百分比均比NC組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖1D、E，表2)，提示高糖刺激增強了細胞的移行能力，這與Western blot結(jié)果相一致。以上結(jié)果提示晶狀體上皮細胞在高糖培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)生了EMT。

2.2高糖抑制HLE-B3細胞內(nèi)自噬水平 為探究高糖環(huán)境下細胞自噬水平的變化，我們檢測了高糖處理HLE-B3細胞0～48h自噬標志蛋白水平的變化。LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62是參與自噬過程的重要蛋白，LC3參與自噬體溶酶體膜的延伸[9]；Beclin 1在自噬的起始階段發(fā)揮重要作用；SQSTM1/p62結(jié)合泛素化蛋白后與LC3形成復(fù)合物，最終在溶酶體內(nèi)降解[10]。Western blot結(jié)果顯示，隨著高糖刺激時間的增加，細胞LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的表達量逐漸降低，而且在24h時達到最低，48h不再有明顯改變(F=163、206，均P<0.0001，圖2A～C，表3)；而SQSTM1/p62的表達量隨著時間的延長逐漸增加(F=302.1，P<0.0001，圖2A、D，表3)。

圖1 HLE-B3細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生EMT A：Western blot檢測高糖刺激HLE-B3細胞48h后EMT標志蛋白E-cadherin和α-SMA的表達；B～C：E-cadherin和α-SMA的表達量化分析(aP<0.05，bP<0.01vs0h；cP<0.05，dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h)；D：細胞劃痕實驗檢測細胞遷移百分比的量化分析(bP<0.01vsNC組)；E：細胞劃痕實驗結(jié)果(×100)。

培養(yǎng)時間E-cadherinα-SMA0h1.22±0.110.56±0.0712h1.03±0.01a0.73±0.02a24h0.87±0.03a,c0.90±0.03a,c48h0.57±0.02a,c,e1.16±0.09a,c,e F67.5253.37P<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vs0h；cP<0.05vs12h；eP<0.05vs24h。

組別0h12h24h48hNC組014.63±3.1327.69±2.5252.75±4.00HG組062.76±3.51b80.84±3.06b90.17±4.51b t-17.7123.2610.75P-<0.0001<0.00010.0004

注：F時間=698.8，P時間<0.0001；F組間=72.95，P組間=0.001；F組間×?xí)r間=12.87，P組間×?xí)r間=0.0005。bP<0.01vsNC組。

2.3上調(diào)HLE-B3細胞的自噬水平可抑制高糖誘導(dǎo)的EMT 為了探討自噬對HLE-B3細胞發(fā)生EMT的調(diào)節(jié)作用，我們使用自噬激動劑雷帕霉素(200nmol/L)對高糖刺激的HLE-B3細胞處理24h，用Western blot檢測HLE-B3細胞自噬和EMT標志蛋白的表達變化。結(jié)果表明，與NC組相比，HG組HLE-B3細胞LC3 Ⅱ/Ⅰ及E-cadherin蛋白表達降低(P=0.0042、0.0001)，而α-SMA蛋白表達增加(P<0.0001)，這與2.1部分的結(jié)果一致；RAPA組與HG組、DMSO組相比，LC3 Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin蛋白表達水平有所提高(P<0.0001、=0.0087；P<0.0001、=0.0245)，α-SMA蛋白表達水平有所降低(P=0.0001、<0.0001)，但與NC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0051、0.0136、<0.0001)，DMSO組與HG組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.9997、0.8625、0.7128)，見圖3A～D，表4，提示雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)高糖引起的自噬水平降低及EMT增強的變化。Transwell實驗結(jié)果表明，與NC組相比，HG組和DMSO組細胞的移行數(shù)量顯著增加(均P<0.0001)，提示高糖促進了HLE-B3細胞的移行，而RAPA組細胞的移行數(shù)量明顯低于HG組和DMSO組(P=0.0002、0.0004)，但仍高于NC組(P=0.0021)，提示雷帕霉素對高糖誘導(dǎo)的細胞移行有所抑制，與Western Blot結(jié)果相一致(圖3E、F，表4)。

圖2 HLE-B3細胞在高糖環(huán)境下自噬水平下降 A：Western blot檢測高糖刺激HLE-B3細胞48h自噬標志蛋白LC3、Beclin 1、SQSTM1/p62的表達變化；B～D：LC3、Beclin 1、SQSTM1/p62蛋白表達的量化分析(bP<0.01vs0h；dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h)。

培養(yǎng)時間LC3Ⅱ/ⅠBeclin 1SQSTM1/p620h1.65±0.051.13±0.050.24±0.0312h1.17±0.06b0.75±0.02b0.66±0.03b24h0.62±0.07b,d0.49±0.05b,d0.81±0.02b,d48h0.66±0.07b,d0.43±0.03b,d0.99±0.04b,d,fF163206302.1P<0.0001<0.0001<0.0001

注：bP<0.01vs0h；dP<0.01vs12h；fP<0.01vs24h。

2.4上調(diào)HLE-B3的自噬水平可抑制TGF-β信號通路 既往研究表明，晶狀體上皮細胞在高糖培養(yǎng)下，細胞TGF-β信號通路被激活，表現(xiàn)為分泌型TGF-β和Smad2/3磷酸化蛋白水平升高[3，11-13]。TGF-β信號通路是細胞發(fā)生EMT的經(jīng)典通路，自噬可能通過影響TGF-β信號通路而影響EMT。因此我們檢測了雷帕霉素對高糖刺激的HLE-B3細胞中TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3及Snail蛋白水平的影響。Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，高糖刺激(HG組、DMSO組)細胞中TGF-β2(P=0.0044、0.008)、p-Smad2/Smad2(均P<0.0001)、p-Smad3/Smad3(均P<0.0001)及Snail(均P<0.0001)蛋白水平均有所升高；加入雷帕霉素處理后，相較高糖刺激(HG組、DMSO組)細胞，TGF-β2表達無明顯改變(P=0.8142、0.5504，圖4A、B，表5)，但p-Smad2/Smad2(P=0.0015、0.0001)、p-Smad3/Smad3(P=0.0111、0.0042)以及Snail(P=0.0042、0.0016)的表達量明顯降低(圖4A、C～E，表5)；但相較NC組，這些指標仍有比較明顯的升高(P<0.0001、=0.0018、0.0131，表5)。以上結(jié)果表明上調(diào)細胞自噬水平可部分抑制高糖激活的由TGF-β2介導(dǎo)的EMT信號通路。

2.5自噬通過SQSTM1/p62與Smad2/3相互作用實現(xiàn)對EMT的調(diào)節(jié) 為了探究自噬信號通路與TGF-β信號通路之間的串擾，我們觀察了SQSTM1/p62與Smad2/3之間的直接交互作用。首先，通過細胞免疫熒光染色觀察兩者的胞內(nèi)分布情況，發(fā)現(xiàn)SQSTM1/p62與Smad2/3均位于細胞質(zhì)，并存在共定位的情況(圖5A)。

對不同處理的HLE-B3細胞進行了SQSTM1/p62的免疫共沉淀實驗，Input部分結(jié)果表明，Smad2/3與SQSTM1/p62在各處理組細胞中均存在，且Smad2/3和SQSTM1/p62在HG組表達高于NC組，而RAPA組與HG組、DMSO組相比，SQSTM1/p62表達有所降低(圖5B，Input)，證實雷帕霉素可以激活細胞的自噬，同時細胞中存在SQSTM1/p62和Smad2/3蛋白表達(陽性對照)。在用SQSTM1/p62抗體進行免疫共沉淀的蛋白復(fù)合物中，通過Western blot檢測到SQSTM1/p62和Smad2/3蛋白，表明SQSTM1/p62與Smad2/3存在相互作用，而且在SQSTM1/p62表達量基本一致的情況下，與NC組相比，HG組結(jié)合的Smad2/3更少，RAPA組與HG組相比有所增加，提示高糖可能抑制了SQSTM1/p62和Smad2/3的結(jié)合，而雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象(圖5B，IP)。

3 討論

白內(nèi)障是糖尿病患者視力損害的主要原因之一[14]。白內(nèi)障摘除術(shù)仍是目前唯一有效的治療方法[15]。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者出現(xiàn)手術(shù)并發(fā)癥風(fēng)險較高，如囊膜收縮和混濁、黃斑水腫和糖尿病視網(wǎng)膜病變加重等[16]。所以，研究藥物防治糖尿病白內(nèi)障很有必要。人們對糖尿病白內(nèi)障發(fā)病機理的探索從未停止，陳文靜等[17]發(fā)現(xiàn)高糖可以抑制HLE-B3細胞葡萄糖關(guān)鍵代謝酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、檸檬酸合成酶、α-酮戊二酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶)的表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究采用高糖刺激HLE-B3細胞以模擬糖尿病患者中晶狀體上皮細胞的生存狀態(tài)，觀察晶狀體上皮細胞EMT及自噬水平的改變，并通過雷帕霉素干預(yù)自噬水平，觀察對細胞發(fā)生EMT的影響，探討自噬對晶狀體上皮細胞EMT的調(diào)節(jié)作用及其機制。

圖3 雷帕霉素增強細胞自噬并抑制高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細胞發(fā)生EMT A：Western blot檢測雷帕霉素對高糖刺激HLE-B3細胞自噬和EMT標志蛋白LC3、E-cadherin和α-SMA表達的影響；B～D：LC3、E-cadherin和α-SMA蛋白表達的量化分析；E：Transwell實驗中細胞遷移數(shù)量的量化分析；F：Transwell實驗結(jié)果(×200)。aP<0.05，bP<0.01vsNC；dP<0.01vsHG；eP<0.05，fP<0.01vsDMSO。

組別LC3 Ⅱ/ⅠE-cadherinα-SMA遷移細胞數(shù)(個)NC組1.61±0.101.16±0.120.45±0.0526.67±3.06HG組1.16±0.10a0.60±0.05a1.16±0.04a79.33±7.37aDMSO組1.17±0.08a0.65±0.04a1.21±0.05a77.00±2.65aRAPA組2.04±0.14a,c,e0.89±0.08a,c,e0.81±0.06a,c,e49.33±4.04a,c,e F45.5231.41157.283.26P<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組；eP<0.05vsDMSO組。

細胞發(fā)生EMT的標志是失去粘附連接和細胞極性，獲得間充質(zhì)表型及獲得運動性和侵襲性[18]，表現(xiàn)在上皮標志物E-cadherin、ZO-1的下調(diào)以及間充質(zhì)標志物N-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin等的上調(diào)。本課題組前期實驗已證明高糖可通過c-Src/TGF-β信號途徑誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞發(fā)生EMT[4]。Zhang等[2]觀察到在白內(nèi)障患者中，晶狀體上皮細胞E-cadherin較正常人表達減少，而間充質(zhì)細胞標志物α-SMA和Vimentin表達增加，表明EMT是糖尿病白內(nèi)障患者晶狀體上皮細胞中的重要事件。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著高糖刺激時間的延長，HLE-B3細胞內(nèi)E-cadherin表達量逐漸下調(diào)，而α-SMA表達量上調(diào)；細胞劃痕實驗提示HLE-B3細胞在高糖環(huán)境下獲得了更強的移行能力，證實高糖刺激晶狀體上皮細胞發(fā)生了EMT。

自噬是一種進化保守的分解代謝過程，通過形成雙層膜的自噬體，將細胞質(zhì)內(nèi)的大分子和細胞器等傳遞至溶酶體進行降解，實現(xiàn)再利用。根據(jù)底物進入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)、微自噬(microautophagy)和巨自噬(macroautophagy)，其中研究的最為透徹是巨自噬。巨自噬受多種信號途徑的調(diào)控，mTOR是自噬的主要調(diào)控因子，其驅(qū)動主要的抑制信號[19]，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雷帕霉素—mTORC1的抑制劑，具有促進自噬的作用[20]。LC3被稱為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAP1LC3)，是公認的自噬標志物。LC3 Ⅰ被Atg7和Atg3相關(guān)的泛素樣系統(tǒng)修飾和處理，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3 Ⅱ[21]。通常用LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ的比值表示細胞自噬水平的高低，比值高代表細胞內(nèi)自噬水平高。Beclin 1作為自噬復(fù)合體的重要組成部分，在自噬活性發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]，其表達水平與自噬活性呈正相關(guān)。作為重要的選擇性自噬接頭蛋白，SQSTM1/p62在自噬清除泛素化蛋白過程中作為受體參與其中，其表達量與自噬水平呈負相關(guān)[23]。本研究中，高糖處理的HLE-B3細胞LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1隨著時間的推移明顯降低，并在24h后維持在較低水平；而SQSTM1/p62隨著時間的延長表達明顯增加。結(jié)果表明，高糖抑制了HLE-B3細胞的自噬。

糖尿病對不同細胞自噬水平的影響似乎不盡相同，但最終對細胞EMT可產(chǎn)生類似的影響。Zhuang等[24]發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病中腎小管上皮細胞自噬受到抑制，抑制血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(serum and glucocorticoid induced kinase，SGK1)可通過PI3K/AKT/mTOR通路促進腎小管上皮細胞自噬和抑制EMT，Jin等[25]研究表明HMGB1通過誘導(dǎo)足細胞自噬參與糖尿病腎病的發(fā)展，HMGB1 siRNA聯(lián)合雷帕霉素可通過抑制AKT/mTOR和TGF-β/Smad信號通路防止足細胞凋亡和EMT進展。既往有關(guān)晶狀體上皮細胞的研究表明，在用TGF-β誘導(dǎo)的后囊膜混濁細胞模型中，使用mTOR抑制劑PP242或者靶向mTOR的siRNA可提高細胞的自噬水平，進而抑制晶狀體上皮細胞的增殖和遷移[26-27]。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素提高了高糖環(huán)境下細胞的自噬水平，部分抑制了高糖誘導(dǎo)的HLE-B3細胞發(fā)生的EMT。

圖4 雷帕霉素抑制高糖激活的HLE-B3細胞中TGF-β信號通路 A：Western blot檢測雷帕霉素對高糖刺激HLE-B3細胞中TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail的蛋白表達的影響；B～E：TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail的蛋白表達的量化分析(aP<0.05，bP<0.01vsNC；cP<0.05，dP<0.01vsHG；fP<0.01vsDMSO)。

圖5 HLE-B3細胞中SQSTM1/p62與Smad2/3蛋白之間的相互作用 A：細胞免疫熒光染色結(jié)果，紅色為Smad2/3，綠色為SQSTM1/p62，藍色為細胞核，白色箭頭所示為黃色，即Smad2/3與SQSTM1/p62共定位所在(×60)；B：免疫共沉淀實驗結(jié)果，Input為陽性對照，Western blot檢測各組細胞均可表達Smad2/3與SQSTM1/p62蛋白；IP為實驗組，用SQSTM1/p62抗體免疫共沉淀后，經(jīng)Western blot檢測蛋白復(fù)合物中SQSTM1/p62、Smad2/3的表達情況。

組別TGF-β2p-Smad2/Smad2p-Smad3/Smad3SnailNC組0.84±0.090.35±0.050.59±0.030.59±0.03HG組1.10±0.04a0.98±0.03a1.00±0.06a1.12±0.10aDMSO組1.07±0.05a1.08±0.06a1.03±0.06a1.15±0.06aRAPA組1.14±0.07a0.77±0.04a,c,e0.82±0.04a,c,e0.81±0.05a,c,e F14.05159.149.8651.93P0.0015<0.0001<0.0001<0.0001

注：aP<0.05vsNC組；cP<0.05vsHG組；eP<0.05vsDMSO組。

為了探究雷帕霉素抑制HLE-B3細胞發(fā)生EMT的原因，我們檢測了雷帕霉素對EMT的經(jīng)典信號通路—TGF-β信號通路關(guān)鍵蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激的HLE-B3細胞中TGF-β2、p-Smad2/3以及EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達增加。雷帕霉素處理后，TGF-β2表達未見明顯改變，而p-Smad2/3以及Snail的表達受到了抑制。提示提高HLE-B3細胞的自噬水平可以抑制高糖激活的TGF-β信號通路，繼而抑制細胞的EMT。那么自噬信號通路又是怎樣與TGF-β信號通路產(chǎn)生串擾呢？研究結(jié)果表明，SQSTM1/p62與Smad2/3存在相互作用，在高糖環(huán)境中這種相互作用有所減弱，雷帕霉素處理后兩者的結(jié)合增強。我們推測SQSTM1/p62作為自噬接頭蛋白，與Smad2/3結(jié)合并介導(dǎo)了Smad2/3通過自噬而降解。高糖環(huán)境下，自噬受到抑制，Smad2/3得以累積，而雷帕霉素提高細胞自噬水平后，自噬對Smad2/3的降解增加，可能引起其中p-Smad2/3的量減少，Smad2/3下游分子Snail也受到抑制，從而抑制了高糖誘導(dǎo)HLE-B3細胞發(fā)生的EMT。

綜上所述，晶狀體上皮細胞HLE-B3在高糖刺激下發(fā)生EMT，同時自噬受到抑制；利用雷帕霉素提高細胞的自噬水平可以通過SQSTM1/p62與Smad2/3的相互作用下調(diào)p-Smad2/3的表達，從而抑制了TGF-β信號通路，起到抑制細胞EMT的作用，表明提高細胞自噬水平可能對高糖刺激的晶狀體上皮細胞具有保護作用，這為未來從自噬角度研發(fā)糖尿病白內(nèi)障的防治藥物提供了理論依據(jù)。但本研究還存在一些局限性，目前的結(jié)果提示200nmol/L雷帕霉素可部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的晶狀體上皮細胞EMT，能否通過改變雷帕霉素的劑量達到完全逆轉(zhuǎn)EMT的作用還有待進一步研究，此外，以上研究結(jié)果還有待在體內(nèi)實驗進行證實。