袁利艷 楊顏?zhàn)?侯曉東

（1 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，開(kāi)封 475000；2 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093）

膝關(guān)節(jié)炎主要因局部病灶軟骨的退行性變使軟骨及關(guān)節(jié)周?chē)∪鈸p害而引起的進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病[1-2]。膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制是關(guān)節(jié)內(nèi)部的軟骨組織出現(xiàn)病變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部結(jié)構(gòu)性破壞及病變[3-4]。膝關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為行動(dòng)不便、膝蓋紅腫、腫脹等。隨著病情的發(fā)展，逐漸會(huì)出現(xiàn)病變關(guān)節(jié)的夜間休息痛，半月板損傷等，由于疼痛，關(guān)節(jié)的正?；顒?dòng)會(huì)受到限制[5-6]。發(fā)病原因有多種因素，其中包括年齡、性別等[7]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性因子能影響軟骨細(xì)胞的代謝，由此得知，炎性反應(yīng)與膝關(guān)節(jié)炎有關(guān)[8]。塞來(lái)昔布膠囊（Celecoxib）屬于非甾體抗炎藥，臨床上通常用來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病。本研究旨在探索塞來(lái)昔布對(duì)膝關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α 信號(hào)通路及關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 模型制備與分組

18 只雄性SD 大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)SD 大鼠中心，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡接近。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

大鼠隨機(jī)分為：模型組，該組大鼠制作膝關(guān)節(jié)炎大鼠模型；假手術(shù)組，該組大鼠在膝關(guān)節(jié)做切口后不做任何處理；治療組，該組大鼠制作膝關(guān)節(jié)炎模型后給予塞來(lái)昔布進(jìn)行治療，每組6 只。分別給予模型組、治療組大鼠膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶溶液，劑量為0.15 mL，濃度為4%，3 d 1次，連續(xù)3次，同時(shí)，給予假手術(shù)組大鼠0.15 mL生理鹽水。大鼠關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)、腫脹，同時(shí)伴隨食欲降低、體質(zhì)量減輕及輕度脫毛等癥狀，則表示造模成功，7 d后，給予治療組大鼠塞來(lái)昔布（4 mg·kg-1·d-1）進(jìn)行治療，每天1次，通過(guò)灌胃給藥方式，模型組、假手術(shù)組大鼠給予等體積的生理鹽水，持續(xù)治療2 個(gè)月。在此期間，所有大鼠在相同環(huán)境下生活。實(shí)驗(yàn)完成后，抽取大鼠靜脈血，將3 組大鼠分別處死并選取關(guān)節(jié)滑膜組織，常規(guī)制成細(xì)胞[9]，并進(jìn)行保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 TUNEL 法檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡

將蓋玻片置于6 孔板內(nèi)，種入細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，為70%～80%。隨后嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TUNEL 染色。加Vectashield Hard Set 封固涂片樣本，標(biāo)記反應(yīng)，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。凋亡率=同一視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量。

1.3 CCK-8 法對(duì)滑膜細(xì)胞增殖數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)

取出滑膜細(xì)胞，稀釋為1×105/mL，培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)好的滑膜細(xì)胞平鋪到16 孔板中，并培養(yǎng)。培養(yǎng)到一定數(shù)量后，加入CCK-8（美侖生物公司，大連）10 μL。常溫放置30 min，利用讀板器檢測(cè)450 nm 光密度值（OD 值）。

1.4 免疫印跡檢測(cè)滑膜細(xì)胞TNF-α 蛋白含量

取滑膜細(xì)胞50 μg，裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量后常規(guī)行免疫印跡檢測(cè)TNF-α表達(dá)。TNF-α抗工作濃度為1∶1 000。以GAPDH 為內(nèi)參，Ⅰmage J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比代表TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 qRT-PCR 法檢測(cè)滑膜細(xì)胞TNF-α mRNA 表達(dá)量

在大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，4 ℃ 1 200 r/min離心，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存。總RNA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，內(nèi)參采用GAPDH。TNF-α上游引物序列 為5'-CTCCCTGGTAGATGGGTTCG-3'；下 游引物序列為5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3'；下游引物序列為5'-CCCTT GTTCCTCACCCACAC-3'。PCR反應(yīng)條件為60 ℃ 10 min，95℃、72℃，各30 s，95℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3次，用相對(duì)定量2-ΔΔCT計(jì)算TNF-α表達(dá)。

1.6 關(guān)節(jié)炎指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)

0 分：膝關(guān)節(jié)沒(méi)有明顯炎癥；1 分：膝關(guān)節(jié)有輕微炎癥；2 分：膝關(guān)節(jié)有輕微紅腫，有炎癥；3 分：膝關(guān)節(jié)紅腫明顯，同時(shí)有明顯炎癥[10]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠滑膜細(xì)胞凋亡比較

模型組、治療組、假手術(shù)組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡率分別為89.38%、46.84%、13.68%。假手術(shù)組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，模型組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞大量凋亡，模型組與假手術(shù)組、治療組比較，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與假手術(shù)組比較，治療組細(xì)胞凋亡數(shù)量增多（圖1，P＜0.05）。

2.2 大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況比較

假手術(shù)組、治療組細(xì)胞增殖較模型組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），假手術(shù)組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖數(shù)量最多，模型組最少，治療組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖較假手術(shù)組明顯減少（圖2，P＜0.05）。

2.3 大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α 蛋白含量比較

假手術(shù)組的TNF-α 蛋白含量最低，模型組蛋白含量最高，與假手術(shù)組、治療組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著上升，治療組TNF-α 蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3，P＜0.05）。

2.4 大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α mRNA 表達(dá)含量比較

模型組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞內(nèi)的TNF-α mRNA 表達(dá)量最高，假手術(shù)組表達(dá)量最低，與假手術(shù)組、治療組比較，模型組TNF-α mRNA 含量顯著升高，治療組TNF-α mRNA 表達(dá)量假手術(shù)組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，P＜0.05）。

2.5 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

7 d 時(shí)，模型制備成功，治療組、模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)相近，隨著給藥時(shí)間的增加，治療組大鼠膝關(guān)節(jié)炎情況逐漸好轉(zhuǎn)，而未服用藥物的模型組大鼠病情逐漸惡化（圖5，表1，P＜0.05）。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（n=6，±s）Tab1 Comparison of arthritis index of three groups of rats（n=6，±s）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（n=6，±s）Tab1 Comparison of arthritis index of three groups of rats（n=6，±s）

*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs treatment group

Group 7 d 21 d 35 d Sham group 0 0 0 Treatment group 1.34±0.01* 1.05±0.04* 0.68±0.12*Model group 1.35±0.04*△ 2.67±0.03*△ 3.10±0.02*△P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

膝關(guān)節(jié)炎是骨科疾病的一種，隨著年齡的增長(zhǎng)，患病人數(shù)不斷增加，該病在中老年人群中出現(xiàn)概率較大[11]。骨關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)退行性病變的結(jié)果，在人的手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱中，膝關(guān)節(jié)最易發(fā)生退變，因此膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病也最廣泛[12]。隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也在迅速增加，膝關(guān)節(jié)炎是一種比較常見(jiàn)的關(guān)節(jié)性病變，很多人在青年時(shí)期就患有該病，但多數(shù)無(wú)明顯癥狀。一旦發(fā)展嚴(yán)重則會(huì)嚴(yán)重影響患者的正常生活，因此，研究有效治療方案成為醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的重點(diǎn)[13]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組、治療組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高，與假手術(shù)組比較，治療組細(xì)胞凋亡數(shù)量多于假手術(shù)組。假手術(shù)組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖數(shù)量最多，模型組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖數(shù)量最少，治療組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖情況比假手術(shù)組相比明顯減少。和假手術(shù)組、治療組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞TNF-α 蛋白含量升高，與假手術(shù)組比較，治療組蛋白含量明顯升高。與假手術(shù)組、治療組比較，模型組TNF-α mRNA 含量顯著升高，與假手術(shù)組比較，治療組mRNA 表達(dá)量明顯增高。在7 d 時(shí)，模型制備成功，治療組、模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)相近，隨著給藥時(shí)間的增加，治療組大鼠膝關(guān)節(jié)炎情況逐漸好轉(zhuǎn)，而未服用藥物的模型組大鼠病情逐漸惡化。

有研究表明，TNF-α 信號(hào)通路參與機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程，在正常生物體內(nèi)TNF-α 信號(hào)通路呈現(xiàn)低表達(dá)，在患病生物體內(nèi)TNF-α 信號(hào)通路呈現(xiàn)高表達(dá)，表明其高表達(dá)能明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞壽命，因此，TNF-α 信號(hào)通路的表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡具有重要作用[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)到膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠存在高濃度的TNF-α mRNA 表達(dá)，在正常細(xì)胞中未檢測(cè)出，表明TNF-α在軟骨退變和骨關(guān)節(jié)炎癥中起重要作用[15]。研究證實(shí)，TNF-α 是膝關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中重要的炎癥遞質(zhì)，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，它與白細(xì)胞介素1 共同參與促進(jìn)軟骨的吸收[16]。研究結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布在膝關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)顯著，能夠明顯降低TNF-α 信號(hào)通路的表達(dá)水平，抑制其凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布作用于患病大鼠時(shí)，大鼠體內(nèi)TNF-α 的表達(dá)水平隨之下降，且塞來(lái)昔布用藥時(shí)間與TNF-α 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即塞來(lái)昔布用藥時(shí)間越長(zhǎng)，TNF-α 表達(dá)水平越低[18]。塞來(lái)昔布與TNF-α 信號(hào)通路的關(guān)系為膝關(guān)節(jié)炎的診斷和治療發(fā)展提供新的科研方向[19-20]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與上述結(jié)論均相同。

綜上所述，塞來(lái)昔布膠囊治療膝關(guān)節(jié)炎大鼠效果顯著，能夠顯著降低TNF-α 信號(hào)通路的表達(dá)水平，改善關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的凋亡情況。

圖1 3 組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡情況，標(biāo)尺=50 μm。A：假手術(shù)組；B：治療組；C:模型組；D：3 組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡率，*P＜0.05 vs 假手術(shù)組；△P＜0.05 vs 治療組.Fig1 Apoptosis of synovial cells in rats of three groups，bar=50 μm.A：Sham group；B：Treatment group；C：Model group；D：Apoptosis rate of synovial cells in rats，*P＜0.05 vs sham group.△P＜0.05 vs treatment group.

圖2 3 組大鼠滑膜細(xì)胞增殖情況。*P＜0.05 vs 假手術(shù)組；△P＜0.05 vs 治療組.Fig2 Proliferation of synovial cells in rats of three groups.*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs treatment group.

圖3 大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α 蛋白含量。A：3 組大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α 蛋白電泳圖；B：3 組大鼠滑膜細(xì)胞中蛋白含量比較，*P＜0.05 vs假手術(shù)組；△P＜0.05 vs 治療組.Fig3 TNF-α protein content in rat synovial cells.A：The electrophoretogram of TNF-α in synovial cells of the rats of three groups，B：Comparison of the protein content of the synovial cells of the three groups of rats，*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs treatment group.

圖4 3 組大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α mRNA 表達(dá)量.Fig4 TNF-α mRNA expression in synovial cells from three groups of rats.*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs treatment group.

圖5 3 組大鼠關(guān)節(jié)組織情況，標(biāo)尺=50 μm.A：假手術(shù)組；B：治療組；C：模型組.Fig5 Joint tissue of rats of three groups，bar=50 μm.A：Sham group；B：Treatment group；C：Model group.