（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京）/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京 100193）

硫氰酸鈉是一種易溶于水的白色斜方系結(jié)晶或粉末，在水中溶解產(chǎn)生硫氰酸根離子（SCN-）和鈉離子（Na+）。因其具有保鮮防腐的功能，在上個(gè)世紀(jì)80年代，硫氰酸鈉作為一種食品添加劑，被普遍應(yīng)用于乳制品行業(yè)。硫氰酸鈉的保鮮作用，主要是通過(guò)硫氰酸根與乳過(guò)氧化物酶作用，阻礙細(xì)菌的正常代謝途徑，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的作用[1]。由于受到當(dāng)時(shí)冷鏈運(yùn)輸技術(shù)不發(fā)達(dá)及運(yùn)輸成本高、乳制品企業(yè)路途較遠(yuǎn)等因素的限制，生乳在收購(gòu)和運(yùn)輸過(guò)程中很容易發(fā)生酸敗變質(zhì)?？紤]到成本低廉、易添加等因素，很多人通過(guò)聯(lián)用過(guò)氧化氫和硫氰酸鈉來(lái)對(duì)牛乳進(jìn)行保鮮，這大大地促進(jìn)了硫氰酸鈉在乳制品行業(yè)，尤其是生乳收購(gòu)過(guò)程中的使用率，進(jìn)而成為遺留至今的問(wèn)題。2008年12月衛(wèi)生部發(fā)布的第一批“違禁及濫用食品添加劑品種名單”中明確規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鈉屬違法添加物質(zhì)[2]。

硫氰酸根是典型的類(lèi)鹵素，帶負(fù)電荷，直線(xiàn)型，多電子離子，與其他原子有較強(qiáng)的絡(luò)合性。大多數(shù)文獻(xiàn)資料中報(bào)道硫氰酸鈉的測(cè)定分析方法有可見(jiàn)分光光度法[3,4]、氣相色譜法[5]、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法[6]、液相色譜法[7-8]、離子色譜法[9～12]和試劑盒法[13]。其中，分光光度法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，但存在顯色不穩(wěn)定、靈敏度低、重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，氣相色譜法需要衍生，且污染環(huán)境[1]。試劑盒法檢出限過(guò)高，無(wú)法精確定量。離子色譜法具有精密度高、選擇性好和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多組分陰離子分離[14]。

離子色譜分離技術(shù)是繼液相色譜、氣相色譜后的第三大色譜分離技術(shù)，主要應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子的分離和測(cè)定[15]。在食品、添加劑、醫(yī)藥、環(huán)境、地質(zhì)各領(lǐng)域都得到了廣泛的拓展和應(yīng)用[16～19]，并成為該領(lǐng)域檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。離子色譜法通過(guò)采用離子交換的原理，用低交換容量的新型離子交換分離柱分離樣品離子，并在分離柱后串接一根高交換容量的特制抑制柱，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)把具有高電導(dǎo)的淋洗液轉(zhuǎn)換成低電導(dǎo)的淋洗液，促使電導(dǎo)檢測(cè)器能靈敏、方便地檢測(cè)出被分離的離子[20]。離子交換色譜適用于易于極化且疏水性強(qiáng)的無(wú)機(jī)、有機(jī)陰離子和陽(yáng)離子的分離。其分離過(guò)程主要是在電場(chǎng)力的作用下，流動(dòng)相中所帶離子和固定相上的親和離子相互交換的過(guò)程，陰離子分離的交換樹(shù)脂為季胺基的交換樹(shù)脂。本研究采用離子色譜法，對(duì)淋洗液、色譜柱、選擇性、前處理?xiàng)l件、線(xiàn)性范圍、方法檢出限與定量限、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)加標(biāo)回收率與精密度、實(shí)驗(yàn)室間加標(biāo)回收率與精密度、標(biāo)準(zhǔn)溶液保存穩(wěn)定性、生乳樣品保存穩(wěn)定性與制備等方面進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化和考察。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，色譜純，F(xiàn)isher；硫氰酸鈉（NaSCN，CAS：540-72-7），純度≥99.99%，SIGMA；微孔過(guò)濾器，0.22μ m，安普；RP柱，1.0mL，Thermo。

1.2 儀器與設(shè)備

離子色譜儀，配電導(dǎo)檢測(cè)器，戴安公司；高速冷凍離心機(jī)，8 000r/min，4℃，日立；分析天平，感量0.1mg、0.01g，賽多利斯；渦旋混勻器，IKA；烘箱，80℃±5℃，MEMMERT；超純水機(jī)，MILLIPORE。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

表1 離子色譜儀淋洗液梯度淋洗條件

色譜柱：氫氧化物選擇性、疏水性低且可兼容梯度洗脫的高容量陰離子交換柱，Dionex IonPac AS16型色譜柱（4mm×250mm）和Dionex IonPac AG16型保護(hù)柱（4mm×50mm）；抑制器：Dionex ASRS-300 4mm陰離子抑制器，外加水抑制模式，抑制器電流為112～149mA，外加水流量1.2mL/min；淋洗液：氫氧化鉀溶液，梯度淋洗，流速為1.0mL/min。色譜淋洗液梯度淋洗條件參見(jiàn)表1。進(jìn)樣體積：100μL；柱溫：30.0℃；電導(dǎo)池溫度：35.0℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg/L）：將硫氰酸鈉于80℃烘箱內(nèi)烘干2h，準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥后的硫氰酸鈉0.1397g，用水定容至100mL，混勻。0～4℃保存，有效期為6個(gè)月。

硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液（10mg/L）：準(zhǔn)確吸取1.00mL硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至100mL，混勻。0～4℃保存，有效期為1個(gè)月。

硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液0、10、20、50、100、500和1 000μL，用水定容至10mL，混勻，得到濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L的硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)工作液。0～4℃保存，有效期為1個(gè)月。

1.3.3 樣品處理

將樣品充分恢復(fù)至室溫，稱(chēng)取4.00g（精確至0.01g）樣品，用乙腈定容至10mL，渦旋混勻1min，靜置20min，置于離心機(jī)上以8 000r/min、4℃離心5min。離心后，準(zhǔn)確移取1.00mL上清液用水定容至10mL，混勻。取上述溶液依次過(guò)0.22μm過(guò)濾器、RP柱，棄去前3mL濾液，收集后面的濾液。將收集的樣品測(cè)試溶液和配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作液同時(shí)置于離子色譜儀上，按儀器色譜分析條件進(jìn)行測(cè)定。用硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，峰面積定量，同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中硫氰酸根的含量以質(zhì)量濃度X計(jì)，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示，按下式計(jì)算：

式中：c為待測(cè)溶液從標(biāo)曲上查得硫氰酸根的濃度（mg/L）；V1為樣品用乙腈提取時(shí)定容體積（mL）；V2為移取離心后上清液的體積（mL）；V3為上清液稀釋定容的體積（mL）；m為試樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

SCN-是疏水性和易極化的陰離子。采用可兼容梯度洗脫的高容量陰離子分離柱——Ion Pac AS 16型分析柱(4mm×250mm)，適用于易極化陰離子的分析，通過(guò)在固定相上鍵合強(qiáng)親水性烷醇基季銨鹽，增強(qiáng)對(duì)OH-的親和力，使用中等濃度的OH-淋洗液，即可以快速分離易極化陰離子，而且峰型對(duì)稱(chēng)、尖銳。

2.2 淋洗液的選擇

本研究選取KOH溶液作為淋洗液，淋洗液OH-由淋洗液自動(dòng)發(fā)生器在線(xiàn)產(chǎn)生，只加水，不用化學(xué)試劑，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)ASRS型抑制器可有效降低背景電導(dǎo)和提高分析物測(cè)定靈敏度。OH-作為淋洗液抑制反應(yīng)產(chǎn)物是水，背景電導(dǎo)較小，通常小于2μS；同時(shí)可采用梯度淋洗，且運(yùn)行梯度時(shí)基線(xiàn)較穩(wěn)，水負(fù)峰小，可大體積進(jìn)樣。經(jīng)優(yōu)化，淋洗液為45mmol/L KOH，可在12min內(nèi)完成硫氰酸根的洗脫出峰，且前后無(wú)明顯干擾峰。

2.3 選擇性試驗(yàn)

由于牛奶樣品在前處理過(guò)程中經(jīng)過(guò)乙腈沉淀蛋白、RP柱除去了疏水性有機(jī)物，因此樣品溶液基質(zhì)中可能對(duì)SCN-檢測(cè)有干擾的是共存的陰離子，因此需要考察所選擇的色譜柱與淋洗液是否能將SCN-與共存離子有效分離。本研究將F-、Br-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-這幾種常見(jiàn)陰離子添加到SCN-標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行分離分析，實(shí)驗(yàn)采用濃度45mmol/L氫氧化鉀溶液作為淋洗液，1.0mL/min的流速進(jìn)行分離，SCN-與其他可能共存的陰離子得到了較好的分離，共存離子對(duì)SCN-檢測(cè)無(wú)干擾。7種陰離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 硫氰酸根離子與6種常見(jiàn)陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖

2.4 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，因此提取過(guò)程中去除蛋白和脂肪是首要考慮的問(wèn)題。蛋白去除不好，提取液很難用針頭濾膜微孔過(guò)濾器過(guò)濾，且過(guò)濾后大分子雜質(zhì)很多，這些成分與分離柱的填料發(fā)生作用，影響柱效和色譜柱的使用壽命。通過(guò)查閱文獻(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，本研究選取乙腈作為提取劑，乙腈的蛋白沉降作用較好，提取液靜置離心后澄清度好，易于后續(xù)過(guò)濾膜及過(guò)固相萃取柱的操作。由于前處理過(guò)程引入有機(jī)溶劑乙腈，而目前通常采用的自動(dòng)循環(huán)抑制模式是利用廢液作再生液，乙腈電解成離子形態(tài)進(jìn)入淋洗液通道，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)分析中基質(zhì)信號(hào)值升高，待測(cè)物質(zhì)峰形拖尾等問(wèn)題，因而實(shí)驗(yàn)采用外加水模式，以避免這種現(xiàn)象。同時(shí)，通過(guò)將乙腈提取液稀釋10倍的操作，將上機(jī)液中乙腈的含量減少至6%。另一方面，生乳中脂肪的含量也較高，而乙腈除脂肪的效果不太好，因此在離心時(shí)將溫度設(shè)定到4℃，有利于脂肪的沉降，可以很明顯地看到水、脂肪、乙腈的界面分層。

牛奶樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，乙腈提取后直接取上清液上機(jī)，樣品中雜質(zhì)組分較多，隨著進(jìn)樣次數(shù)增多柱效隨之下降，直接表現(xiàn)就是待測(cè)物保留時(shí)間提前，分離度下降。本研究采用OnGuard II RP柱去除污染分離柱和干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有機(jī)物。RP柱是一種反相固相萃取柱，鍵合基團(tuán)為含有一個(gè)微孔的二乙基苯，性能類(lèi)似C18柱，主要用于去除疏水性大分子物質(zhì)。取提取液1mL，用水稀釋10倍后，過(guò)OnGuard II RP柱（使用前需用5mL甲醇+10mL水進(jìn)行活化），調(diào)整流速在1mL/min左右，棄去前3mL樣品流出液，收集濾液待測(cè)。經(jīng)凈化處理，樣品中的脂肪、蛋白等有機(jī)殘留物被吸附在OnGuard II RP柱上，而待測(cè)分析物在OnGuard II RP柱上基本沒(méi)有保留，直接流出OnGuard II RP柱，樣品凈化效果良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液保存穩(wěn)定性

表2 硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0～4℃保存穩(wěn)定性

離子色譜法檢測(cè)硫氰酸根是外標(biāo)法定量，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度是否穩(wěn)定會(huì)直接影響結(jié)果。取濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00mg/L的硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在0～4℃保存1d、30d、48d后分別測(cè)定分析，峰面積如表2所示。結(jié)果表明硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0～4℃保存下穩(wěn)定性較好，有效期大于一個(gè)月。

2.6 方法線(xiàn)性范圍

配制7點(diǎn)不同濃度工作曲線(xiàn)：將硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液（10mg/L）用水稀釋?zhuān)频脴?biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，濃度為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，在本法所確定的試驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得到硫氰酸根的峰面積。以硫氰酸根的濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，硫氰酸根的峰面積y（μS＊min）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在0.01～1.0mg/L范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程y=0.7235x-0.0023，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

圖2 硫氰酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（B）

2.7 方法檢出限與定量限

在優(yōu)化的測(cè)定條件下，離子色譜儀對(duì)硫氰酸根的檢出限（S/N=3）為0.01mg/L，定量限（S/N=10）為0.03mg/L。在本研究過(guò)程中，組織了6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢出限進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明，6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)濃度為0.01mg/L的硫氰酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的信噪比均大于3（表3和圖3）?？紤]到樣品前處理過(guò)程中的稀釋倍數(shù)為25倍，本試驗(yàn)在比對(duì)驗(yàn)證工作中，制備了生乳中添加最低濃度點(diǎn)為0.25mg/kg的加標(biāo)樣品，驗(yàn)證結(jié)果表明信噪比均大于10，且均具有較好的回收率。因此，本方法對(duì)牛奶中硫氰酸根的檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg。

圖3 硫氰酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mg/L）的離子色譜圖（5次重復(fù)）

表3 不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)硫氰酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液檢出限的驗(yàn)證結(jié)果

2.8 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)加標(biāo)回收率和精密度

本方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)回收率和精密度試驗(yàn)，以生乳為樣品基質(zhì)，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得硫氰酸根的回收率和精密度匯總于表4?；厥章史秶?4.6%～104.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.2%～9.2%之間。

2.9 實(shí)驗(yàn)室間加標(biāo)回收率和精密度

本方法分別在6家有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其重復(fù)性與再現(xiàn)性。以生乳為樣品基質(zhì)，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)。測(cè)得硫氰酸根的回收率和精密度匯總于表5?；厥章史秶?3.7%～100.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在4.5%～13.4%之間。通過(guò)比對(duì)6家單位的結(jié)果顯示，本方法具有良好的重復(fù)性與再現(xiàn)性。

表4 生乳中硫氰酸根添加回收率及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果

表5 生乳中硫氰酸根添加回收率及實(shí)驗(yàn)室間精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對(duì)生乳中硫氰酸根測(cè)定離子色譜法的色譜柱、選擇性、前處理?xiàng)l件、線(xiàn)性范圍、方法檢出限與定量限、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)加標(biāo)回收率與精密度、實(shí)驗(yàn)室間加標(biāo)回收率與精密度方面進(jìn)行了優(yōu)化和考察。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出該方法的檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)回收率范圍84.6%～104.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍1.2%～9.2%，實(shí)驗(yàn)室間回收率范圍93.7%～100.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍4.5%～13.4%，該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。