（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

奶酒因營養(yǎng)豐富、保健功效顯著而得到人們的關(guān)注和認(rèn)可[1]，然而，奶酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到缺乏成熟發(fā)酵劑的制約[2]。目前，奶酒菌株的分離和篩選多采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，但是這些方法得到的微生物信息比較有限，對微生物多樣性及其動態(tài)變化的認(rèn)識存在一定的局限性。最近發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)為分析復(fù)雜的微生物體系提供了一種高效便捷的方法，能夠獲得微生物群落中的全部微生物的遺傳信息[3]。因此，本研究擬通過高通量測序技術(shù)分析采集到的奶酒發(fā)酵醪在奶酒釀制過程中細(xì)菌和真菌多樣性的動態(tài)變化，從而為后續(xù)菌種的篩選及最適的菌株配比提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶酒發(fā)酵醪：收集錫林郭勒盟牧民家中以自然富集菌種發(fā)酵風(fēng)味比較好的新鮮馬奶酒發(fā)酵醪，用無菌離心管收集后置于冰袋中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并置于-20℃冰箱中待測。

三羥甲基氨基甲烷，美國Amresco公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸二鈉，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌宏基因組DNA提取試劑盒25T/50T，北京福德安科技（北京）有限公司產(chǎn)品；10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶、上樣緩沖液（6×Loading Buffer），寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB）溶液，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖（Regular Agarose G10），BIOWEST公司產(chǎn)品；引物及2kbp DNA標(biāo)記物，賽默飛世爾科技公司合成；高通量測序試劑，諾禾致源生物信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗器，上海易凈超聲波儀器有限公司；ZQJ-254型紫外強(qiáng)度計(jì)，上海顧村電光儀器廠產(chǎn)品；超凈工作臺，北京王堂藍(lán)翼科技有限公司；超低溫冰箱（MDF-382E），Sanyo公司；小型離心機(jī)，Sigma公司；低溫高速離心機(jī)（Centrifuge 5804R），Eppendon公司；PCR擴(kuò)增儀（ALD1244），BioRad公司；定量PCR儀（CFX96），BioRad公司；凝膠成像儀（GelDoc-It Imagine System），UVP公司；高通量測序儀（Miseq），Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品收集

將奶酒發(fā)酵醪按1%（w/w）加入到牛奶中發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后，采集發(fā)酵樣品，分別放入滅菌后的離心管，并轉(zhuǎn)移到-20℃的冰箱中貯藏，用于細(xì)菌和真菌多樣性的檢測。

1.3.2 DNA提取

取2g奶酒樣品溶液置于滅菌離心管中，在4℃下13 000r/min離心90min后，按照福德安細(xì)菌DNA提取試劑盒的說明提取奶酒樣品中的總DNA。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳

取提取的DNA樣品4μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120V，時(shí)間為20min。電泳后凝膠在凝膠成像儀拍照。

1.3.4 內(nèi)參rRNA的混合及PCR

表1 rRNA擴(kuò)增的引物

為了實(shí)現(xiàn)對各個(gè)樣品rRNA測序數(shù)據(jù)的相對定量比較，在提取到的奶酒樣品的總DNA中加入等體積等濃度的內(nèi)參rRNA溶液進(jìn)行PCR。奶酒細(xì)菌和真菌擴(kuò)增的引物如表1所示。

奶酒16S rRNA V3-V4擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系如下：ddH2O 11.6μL，5 × FastPfu buffer 4μL；2.5mmol/L dNTPs 2μL；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L）1μL；FastPfu 聚合酶0.4μL；BSA 0.2μL；DNA模板10ng；總體系20μL。奶酒ITS rRNA 1F-2R擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系如下：ddH2O 14μL，10×buffer 2μL；2.5mmol/L dNTPs 2μ L；正向引物（5μmol/L）0.8μL；反向引物（5μmol/L） 0.8μL；rTaq 聚合酶0.2μL；BSA 0.2μL；DNA模板10ng；總體系20μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s），72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物3μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。奶酒樣品的建庫和高通量測序均委托北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.5 擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

測序數(shù)據(jù)處理見操作步驟。將所有樣品的全部最終有效數(shù)據(jù)利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）[4]進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時(shí)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則篩選出在OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA[5]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[6]進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8-1），獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平：kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。以內(nèi)參16S rRNA的數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，并統(tǒng)計(jì)奶酒釀制期間的門和屬水平的群落組成、菌落的相對豐度。對OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行α多樣性指數(shù)計(jì)算，并對結(jié)果進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性的動態(tài)變化

2.1.1 Shannon指數(shù)變化情況

Shannon指數(shù)是衡量樣品物種多樣性的重要指標(biāo)，也是α多樣性指數(shù)之一。奶酒發(fā)酵醪加入到牛奶中發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后的細(xì)菌Shannon指數(shù)如圖1所示。細(xì)菌Shannon指數(shù)在奶酒發(fā)酵的過程中先下降后上升，第7天后又開始下降，在第2天降到最低點(diǎn)并顯著低于其他發(fā)酵時(shí)間。這表明奶酒在釀制過程中，細(xì)菌的多樣性先下降后上升再下降。

圖1 細(xì)菌Shannon指數(shù)的動態(tài)變化

2.1.2 門水平上的菌群多樣性變化

奶酒在釀制期間細(xì)菌門水平上的多樣性變化情況如圖2所示。在整個(gè)發(fā)酵過程中，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria），其中，變形菌門和厚壁菌門占主導(dǎo)地位。厚壁菌門的相對豐度先升高，第3天達(dá)到峰值后開始下降，而變形菌門的相對豐度則先降后升，在第8天之后占絕對主導(dǎo)。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等著名的種類[7]。厚壁菌門多數(shù)為革蘭氏陽性菌，包括常見的乳酸菌等食品發(fā)酵菌株。

圖2 細(xì)菌門水平的相對豐度動態(tài)變化

2.1.3 屬水平上的菌群多樣性變化情況

奶酒在釀制期間細(xì)菌屬水平上的多樣性變化情況如圖3所示。從圖中可以看出，乳球菌屬（Lactococcus）的相對豐度在發(fā)酵前期不斷增長，到第3天達(dá)到峰值，為37.99%，然后開始下降并保持一定的比例。乳酸乳球菌是發(fā)酵工業(yè)中常用發(fā)酵劑之一，特別是在發(fā)酵乳制品中，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，如干酪、酸奶和奶油等[8]。乳酸乳球菌能夠賦予發(fā)酵乳制品良好的質(zhì)地和風(fēng)味，具有極高的工業(yè)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度也有較快的增長，在前3d為第一豐度菌群，最高為41.09%，后期并保持一定的比例。

圖3 細(xì)菌屬水平的相對豐度動態(tài)變化

2.2 真菌多樣性的動態(tài)變化

2.2.1 Shannon指數(shù)變化情況

奶酒發(fā)酵醪加入到牛奶中發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7、8、9d后的真菌Shannon指數(shù)如圖4所示。真菌Shannon指數(shù)在奶酒發(fā)酵的過程中一直處于下降趨勢，這表明真菌的多樣性在減少。

圖4 真菌Shannon指數(shù)的動態(tài)變化

2.2.2 門水平上的真菌多樣性變化情況

經(jīng)分析比對已得的OTUs，共鑒定到6個(gè)門（圖5），分別是壺菌門（Chytridiomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、孢霉門（Mortierellomycota）、隱真菌門（Rozellomycota）、芽枝霉門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota）。其中，芽枝霉門的相對豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷下降，子囊菌門的相對豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷增加。子囊真菌是單系真菌，約占所描述真菌的75%。在子囊菌中有一些著名的真菌：釀酒酵母、商業(yè)酵母等，其是烘焙和釀造工業(yè)的基礎(chǔ)菌株。還有一些臭名昭著的子囊真菌，如黃曲霉菌。黃曲霉毒素是一種已知的最有效的天然致癌物[10]。

圖5 真菌門水平的相對豐度動態(tài)變化

2.2.3 屬水平上的真菌多樣性變化情況

圖6 真菌屬水平的相對豐度動態(tài)變化

圖6為奶酒釀制過程中屬分類水平下的真菌動態(tài)變化情況。在發(fā)酵的前6d，豐度占比最高的為酵母菌屬（Saccharomyces），其相對豐度基本保持在62%左右的水平。酵母菌屬是一種形狀呈細(xì)胞圓形、橢圓形或柱形的無性繁殖的重要真菌，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等糖類產(chǎn)生酒精，在釀酒工業(yè)中有著重要應(yīng)用[11]。其次是曲霉屬（Aspergillus），比例約為33%。曲霉屬中部分菌種可將淀粉質(zhì)原料轉(zhuǎn)化成葡萄糖，而且糖化力強(qiáng)，繁殖速度快，熱穩(wěn)定性良好，耐酸，耐酒精，不產(chǎn)或少產(chǎn)可降低甲醇生成量的果膠酶。由于它們具有酶系豐富、產(chǎn)酶活性高、生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、易于管理等特點(diǎn)，是釀酒微生物的重要組成部分[12]。

3 結(jié)論

奶酒在發(fā)酵過程中細(xì)菌的Shannon指數(shù)先下降后上升，在第2天降到最低點(diǎn)后開始上升，到第7天后又開始下降。在整個(gè)發(fā)酵過程中，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)門，分別是變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門、放線菌門。其中，變形菌門和厚壁菌門占主導(dǎo)地位。厚壁菌門的相對豐度先升高，第3天達(dá)到峰值后開始下降，而變形菌門的相對豐度則先降后升，在第8天后占絕對主導(dǎo)。乳球菌屬的相對豐度在發(fā)酵前期不斷增長，到第3天達(dá)到峰值，為37.99%，然后開始下降并保持一定的比例。

奶酒發(fā)酵過程中真菌的Shannon指數(shù)一直處于下降趨勢，經(jīng)分析比對已得的OTUs，共鑒定到5個(gè)門，分別是壺菌門、擔(dān)子菌門、孢霉門、隱真菌門、芽枝霉門和子囊菌門。其中，芽枝霉門的相對豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷下降，子囊菌門的相對豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷增加。在發(fā)酵的前6d，豐度占比最高的為酵母菌屬（Saccharomyces），其相對豐度基本保持在62%左右的水平，其次是曲霉屬（Aspergillus），比例約為33%。本研究結(jié)果可為奶酒發(fā)酵菌株的分離、篩選和鑒定提供參考依據(jù)。