劉琴，張泉鵬，周亞平，孟興祥，成玉梅，施開平，李國平，彭雅婷

（1.昆明市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，昆明 650401；2.云南省嵩明縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，嵩明 651700）

支原體舊稱霉形體，是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細胞型微生物，大小為0.1～0.3μm。支原體廣泛存在于人和動物體內(nèi)，能夠引起奶牛肺炎、關節(jié)炎、乳房炎、生殖器官炎癥等，1961年首次在美國奶牛乳房炎中分離到支原體，在我國1983年首次報道了奶牛乳房炎乳中分離到支原體。支原體感染的乳房炎病程長，治療費用高。大腸桿菌乳房炎在臨床上很常見，主要是由于環(huán)境衛(wèi)生差、消毒不徹底以及擠奶操作不當所造成。2019年5月，昆明市某奶牛場發(fā)生了一起乳房炎病例，共3頭發(fā)病，臨床表現(xiàn)為乳房腫硬、乳區(qū)發(fā)熱，乳汁黃色呈豆腐渣或絮狀。經(jīng)細菌分離鑒定和奶牛乳房炎四重PCR診斷為大腸桿菌和支原體混合感染。現(xiàn)將其報告如下。

1 材料

1.1 病料

用無菌注射器抽取病牛乳房中乳汁，共3頭牛的3份患乳區(qū)混合樣品。

1.2 儀器

全自動細菌鑒定儀（VITEK 2 COMPACT，法國梅里埃）、冷凍離心機（貝克曼）、熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS美國ABI，無Cy5熒光通道），生化培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.3 試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、血平皿、革蘭氏陰性生化鑒定卡（法國梅里埃）、革蘭氏陰性細菌藥敏卡片（法國梅里埃），4聯(lián)牛乳房炎病原菌核酸檢測試劑盒（含DNA提取試劑，深圳易瑞），革蘭氏染色液（環(huán)凱生物）。

2 方法

2.1 細菌分離和革蘭氏染色鑒定

2.1.1 細菌培養(yǎng)

滅菌劃線法將乳汁分別接種于普通瓊脂平皿和血平皿上，37℃培養(yǎng)24～48h。

2.1.2 革蘭氏染色及鑒定

挑取典型菌落按照革蘭氏染色法進行染色，鏡檢初步確定細菌的形態(tài)和革蘭氏陰性或陽性。

2.2 細菌鑒定和藥敏試驗

將經(jīng)分離鑒定的可疑菌株用普通瓊脂平板純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h。無菌挑取純培養(yǎng)物混懸于3mL無菌生理鹽水（0.45%NaCl溶液）中，用比濁管配置相當于與0.50～063麥氏單位的菌懸液。按照全自動細菌鑒定儀操作說明書對可疑菌落進行鑒定和藥敏試驗。革蘭氏陰性細菌鑒定卡為47種生化反應，藥敏試驗為18種常用抗生素和ESBL（產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶）。

2.3 乳汁核酸提取和PCR檢測

按照PCR檢測試劑盒的說明書進行DNA提取和熒光PCR檢測。4聯(lián)乳房炎試劑盒采用4重Q-PCR技術(shù)，通過PCR MIX金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌等4種病原菌檢測。金黃色葡萄球菌（Sau）報告熒光為FAM；無乳鏈球菌（Sag）報告熒光為JOE；牛支原體（Myb）報告熒光為ROX；牛棒狀桿菌（Cb）報告熒光為Cy5。由于熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS）無Cy5通道，用VIC通道替代。

反應體系設為2 5 u L，反應程序為：去污染（50℃，3min）、預變性（95℃，3min）、擴增（95℃，15s；60℃，40s），40個循環(huán)。

質(zhì)量控制：

陰性對照：PCR反應液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、Cy5通道均無擴增曲線，個別通道的陰性對照出現(xiàn)翹尾信號，Ct值≥35時，不影響結(jié)果判讀。

陽性對照：PCR反應液1的FAM通道、JOE通道、ROX通道、VIC通道均有擴增曲線，Ct值均≤30。

結(jié)果判斷：Ct小于或等于36（無乳鏈球菌Ct小于或等于34）判為陽性，Ct在36～38之間（無乳鏈球菌Ct在34～38）判斷為可疑，Ct大于38判為陰性。結(jié)果保留整數(shù)部分。

3 結(jié)果與討論

3.1 細菌分離及鑒定結(jié)果

經(jīng)細菌培養(yǎng)，普通瓊脂平板和血平皿上均長出邊緣整齊，圓形，濕潤、光滑、呈灰白色的菌落，血平皿無典型溶血。對分離到的9個菌株經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)均為短粗、兩端鈍圓的陰性桿菌。經(jīng)對該細菌采用革蘭氏陰性鑒定卡進行自動細菌鑒定，系統(tǒng)顯示該菌株為大腸桿菌（符合率達到99%）。大腸桿菌是奶牛乳房炎的主要病原菌之一，臨床上感染病例較普遍。葛影影等調(diào)查河南地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌，分離到11種287株致病菌，其中大腸桿菌是主要致病菌之一，占總檢出數(shù)的5.57%[1]。廖智慧等從衡水地區(qū)不同的奶牛場采集60份患乳房炎奶牛奶樣，分離鑒定出20株大腸桿菌[2]。

3.2 細菌藥敏試驗鑒定結(jié)果

梅里埃全自動藥敏試驗鑒定結(jié)果顯示，ESBL陰性，對常用的頭孢類、氟喹諾酮、磺胺類、氨基糖苷類抗生素都較敏感，說明該大腸桿菌菌株不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。這與其他報道的結(jié)果有差異，許有盼對乳房炎中得到的大腸桿菌藥敏結(jié)果顯示，對氟苯尼考、頭孢曲松、頭孢他啶、恩諾沙星4種藥物高度敏感；對新霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、阿莫西林、阿米卡星、青霉素、卡那霉素7種藥物耐藥[3]。武軍元等在新疆阿克蘇地區(qū)從患有乳房炎的奶牛病例中分離到的大腸桿菌，經(jīng)耐藥性檢測表明，對氨芐西林的耐藥性最高，達到了50%；對多西環(huán)素、四環(huán)素和鏈霉素的耐藥性次之，為40%；而對環(huán)丙沙星、阿米卡星、諾氟沙星則比較敏感[4]。廖智慧等的藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌對頭孢克肟、恩諾沙星、丁胺卡那、強力霉素4種藥物敏感，對其他藥物存在不同程度的耐藥性[2]。細菌的耐藥性與濫用抗生素有關，該大腸桿菌耐藥性不強的原因可能與該場建廠年限短、用藥比較規(guī)范有關。

3.3 熒光定量PCR診斷結(jié)果

經(jīng)對3份乳樣進行DNA提取和PCR擴增熒光檢測，四種細菌Ct結(jié)果見表1。

表1 乳樣中四種細菌熒光PCR檢測結(jié)果

從表1可見，1、2號樣品支原體Ct分別為27、24，3號樣品無支原體擴增曲線，其他三種細菌未見擴增曲線，判定為支原體感染。3號樣品未檢測到支原體原因可能是該牛發(fā)病較早，一直采用中藥制劑治療，奶牛已處于康復期。由于熒光定量PCR儀（STEP ONE PLUS）無Cy5通道，用VIC通道替代，陽性對照Ct顯示為27，說明有一定參考意義。支原體在環(huán)境中較普遍，是奶牛乳房炎常見的致病性微生物[5～8]。夏文華對甘肅省張掖市臨澤縣奶牛支原體感染情況調(diào)查顯示，奶牛血清樣品支原體平均陽性率50.71%[9]。曾偉權(quán)在乳房炎臨床癥狀的奶牛中采集牛奶樣本，經(jīng)細菌培養(yǎng)和支原體培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察、生化試驗、特異性PCR鑒定和16SrRNA測序?qū)Ψ蛛x株進行鑒定，證實為支原體乳房炎[10]。

3.4 用藥建議

細菌分離鑒定和熒光PCR診斷結(jié)果說明，該乳房炎為支原體和大腸桿菌混合感染。結(jié)合藥敏試驗的結(jié)果和支原體敏感的抗生素種類，推薦該場采用氟喹諾酮類抗生素等治療該乳房炎。由于牛支原體對大部分抗生素不敏感，大部分在體外藥敏結(jié)果中表現(xiàn)敏感的抗生素，在治療時效果均不理想，這也可能與奶牛血乳屏障阻礙了藥物進入乳腺有關。彭清潔等認為，支原體治療要對癥治療，如發(fā)熱可用安乃近、復方氨基比林等解熱藥；體質(zhì)弱的牛要補充能量和VC及復合VB、ATP等[6]。

4 結(jié)論

4.1 本例奶牛支原體乳房炎在云南系初次報道，原因可能是支原體細菌培養(yǎng)要求較高，采用常規(guī)的細菌培養(yǎng)效果不理想，本試驗采用了核酸診斷方法，大大提高了檢測靈敏度和特異性。

4.2 本病例奶樣中分離出大腸桿菌，且耐藥性不強，說明系支原體乳房炎的繼發(fā)感染。大腸桿菌在牛體上及環(huán)境中廣泛存在，是條件性致病菌，當奶牛抵抗力下降時容易引起疾病，因此要加強環(huán)境衛(wèi)生的管理和乳房擠奶前后的藥浴。

4.3 由于本例乳房炎檢測時未準備支原體的藥敏試驗檢測卡，所以未進行藥敏試驗，僅根據(jù)藥理學的特點推薦了用氟喹諾酮類抗生素治療該病。

4.4 今后要提高對該病的重視，開展預防、診斷和治療方面的研究，以便更好地為奶業(yè)服務。