王靈通，陳瑋，王燕，湯春光，尹富華

（臨海市第二人民醫(yī)院，浙江 臨海 317016）

老年冠心病患者易發(fā)生腦梗死（CI）[1]。微小RNA（miRNA）是在多種疾病發(fā)展進(jìn)程中異常表達(dá)的RNA小分子，具有臨床診斷和評(píng)估的價(jià)值[2]。冠心?。–HD）發(fā)生后，外周血miRNA表達(dá)異常。微小RNA-19a（miR-19a）在冠心病患者血清中高表達(dá)，并與冠心病患者發(fā)生主要心臟不良事件有關(guān)[3]。miR-18a、miR-19a與缺血性疾病關(guān)系密切，但兩者在冠心病并發(fā)腦梗死患者血清中的表達(dá)意義尚無(wú)相關(guān)研究?；诖?，本研究探討血清miR-18a、miR-19a在老年冠心病發(fā)生腦梗死患者中的表達(dá)意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年11月-2020年4月本院收治老年CHD并發(fā)CI患者109例 （CHD并發(fā) CI組），納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥60 歲；（2）臨床資料齊全；（3）經(jīng)超聲心動(dòng)圖、頭顱螺旋CT、冠狀動(dòng)脈造影檢查并確診；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)菌感染性心內(nèi)膜炎、慢性風(fēng)濕性心臟瓣膜病、心肌炎、慢性心力衰竭、先天性心臟病者；（2）合并免疫系統(tǒng)疾病、腦出血、結(jié)締組織病、精神障礙者；（3）合并急慢性感染、惡性腫瘤、臟器功能衰竭者；（4）近期有手術(shù)、創(chuàng)傷、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)病史者；（5）合并中毒性肝炎、脂肪肝、肝病史、膽囊炎、膽石癥者；（6）近期服用抗炎、抗血小板凝集、免疫抑制劑患者。選取同期收治的老年單純冠心病患者113例為CHD組。兩組性別、年齡一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)且患者知情同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 納入影響老年冠心病并發(fā)心肌梗死的10個(gè)因素，包括性別、年齡、吸煙史、高血壓史、高血脂史和糖尿病史以及血清miR-18a、miR-19a、MMP-9、D-D表達(dá)水平，采用單因素和Logistic多因素回歸分析miR-18a和miR-19a在老年冠心病并發(fā)腦梗死患者中的表達(dá)意義。

1.2.1 儀器與試劑 TRIzol Reagent購(gòu)于武漢科昊佳生物科技有限公司（批號(hào)：15596-026）；一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司（批號(hào)：MT0005-IDV）；miRNA QPCR Master Mix試劑盒購(gòu)于上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司（批號(hào)：600583）；MMP-9檢測(cè)采用ELISA法，試劑盒（批號(hào)：K4427-1）購(gòu)于孟成科技（上海）有限公司；D-D采用ELISA法，試劑盒購(gòu)于上海古朵生物科技有限公司（批號(hào)：GD-JX0960）。 nanodrop1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海在途生物科技有限公司；StepOne TM采用qRT-PCR，儀購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（上海）。

1.2.2 樣本采集與檢測(cè) 收集兩組清晨空腹外周血6～8mL，靜置約40分鐘，4℃下轉(zhuǎn)速 10000r/min離心13分鐘，取上層血清，分裝于無(wú)RNA酶的1.5mL凍存管中，于-80℃冰箱中保存，待檢。（1）qRT-PCR 法檢測(cè)血清miR-18a、miR-19a表達(dá)。-80℃冰箱中取出血清樣本，冰上溶解，按照TRIzol法抽提血清樣本總RNA，以N-D 1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣本總RNA濃度和純度，A260/A280比值在1.6～2.0范圍為合格樣本，進(jìn)行下一步操作。按照一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照miRNA QPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)配制擴(kuò)增反應(yīng)體系，采用實(shí)時(shí)熒光定量StepOne TM PCR儀將樣本cDNA擴(kuò)增、檢測(cè)。miR-18a、miR-19a均以U6為內(nèi)參，其對(duì)應(yīng)引物序列詳見(jiàn)表 2，其相對(duì)表達(dá)水平用 2-ΔΔCt計(jì)算。 （2）采用ELISA法檢測(cè)血清MMP-9、D-D水平。具體操作步驟及注意事項(xiàng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表2 miR-18a、miR-19a及內(nèi)參U6的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析探討老年冠心病并發(fā)腦梗死的影響因素。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析 納入影響老年冠心病并發(fā)心肌梗死的10個(gè)因素中，與CHD組比較，CHD并發(fā)CI組血清miR-19a、MMP-9、D-D水平均升高，血清miR-18a表達(dá)水平降低，合并高血脂患者比例較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 老年冠心病患者并發(fā)腦梗死風(fēng)險(xiǎn)的單因素分析

2.2 多因素Logistic回歸分析 高血脂病史、miR-19a、MMP-9、D-D是老年冠心病并發(fā)腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），而 miR-18a為保護(hù)因素（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表 4。

表4 老年冠心病患者發(fā)生腦梗死的多因素Logistic回歸分析

3 討論

老年冠心病患者易發(fā)生腦供血不足，引發(fā)腦梗死，造成偏癱、半身不遂[4]。探討冠心病并發(fā)腦梗死的危險(xiǎn)因素并進(jìn)行臨床監(jiān)控在一定程度上可減少腦梗死的發(fā)生。

miRNA可在細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、機(jī)體代謝、組織分化、個(gè)體發(fā)育、凝血/纖溶平衡等過(guò)程中發(fā)揮重要的生物調(diào)控作用[5-8]。羅建華等[9]研究顯示，血清miR-18a在急性心肌梗死患者中表達(dá)異常，其對(duì)診斷及評(píng)估急性心肌梗死病情具有較好的參考價(jià)值。本研究中老年CHD并發(fā)CI組血清miR-18a表達(dá)水平明顯低于CHD組，推測(cè)miR-18a作為miRNA的一員，通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、凝血/纖溶平衡、炎癥反應(yīng)，從而在老年冠心病并發(fā)腦梗死中起重要作用。

細(xì)胞學(xué)研究顯示，miR-19a在動(dòng)脈缺血過(guò)程及改善缺血引發(fā)血流減少的癥狀中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10]。miR-19a-3p是miR-19a其中一員，其可能與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11-12]。此外，miR-19a在急性心肌梗死患者的血清中過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向磷酸酶-張力蛋白基因而影響缺血再灌注心肌損傷過(guò)程，miR-19a有望成為缺血再灌注心肌損傷的臨床診斷標(biāo)志物[13]。以上研究表明，miR-19a可能在缺血性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究中，老年CHD并發(fā)CI組血清miR-19a表達(dá)水平高于CHD組，分析原因，miR-19a可能通過(guò)影響脂蛋白生物合成、缺氧誘導(dǎo)因子激活缺氧反應(yīng)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路、脂肪因子信號(hào)通路、血管生成、凝血/纖溶平衡等生物學(xué)過(guò)程[14]，進(jìn)而在老年冠心病患者并發(fā)腦梗死中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a是老年冠心病并發(fā)腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），而miR-18a為保護(hù)因素（P＜0.05）。此外，本研究尚發(fā)現(xiàn)高血脂史和MMP-9、D-D也是老年冠心病并發(fā)腦梗死的危險(xiǎn)因素。MMP-9是一種蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)斑塊破裂、繼發(fā)血栓形成，進(jìn)而促發(fā)CHD和CI[14]；D-D是纖溶酶水解交聯(lián)纖維蛋白產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，其作為繼發(fā)纖溶亢進(jìn)、血栓形成的有效指標(biāo)，與CHD、CI凝血、纖溶失衡關(guān)系緊密[14-16]。 周華等[14]發(fā)現(xiàn)，MMP-9、D-D在急性腦缺血性CI患者中表達(dá)均上調(diào)，兩者可作為急性腦缺血性腦梗死的輔助診斷標(biāo)志物。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，冠心病并發(fā)腦梗死后血腦屏障可能被破壞，局部病灶組織MMP-9進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，血清MMP-9水平升高，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，引起血管重構(gòu)、血管內(nèi)膜增厚，促進(jìn)冠心病并發(fā)腦梗死。此外，冠心病并發(fā)腦梗死的損傷腦組織產(chǎn)生的組織因子使機(jī)體凝血活性增加，且病灶附近水腫可引起局部壓迫性微循環(huán)，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，纖溶活性增加，D-D水平升高，從而在冠心病并發(fā)腦梗死的血栓過(guò)程中起作用[14]。

以上論述表明，動(dòng)態(tài)檢測(cè)miR-18a、miR-19a水平有利于防治老年冠心病并發(fā)腦梗死。