王 蓉，曹海寧，李 娟

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院圖書(shū)館，湖南 衡陽(yáng) 421005）

天然類(lèi)胡蘿卜素的組成單位是四萜，由其組成不飽和度很高的一類(lèi)異戊二烯構(gòu)成物在自然界的分布很廣泛，一般為紅、橙、黃等顏色[1]。四萜的化學(xué)組成為40 個(gè)碳原子構(gòu)成的多烯鏈，末尾為一兩個(gè)終止或單極循環(huán)組，主要分布在一些植物和微生物細(xì)胞中，還能存在于動(dòng)物的組織中，但要經(jīng)過(guò)食物鏈進(jìn)行轉(zhuǎn)化[2]。藻類(lèi)、霉菌、細(xì)菌和紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、法夫酵母屬及擲孢酵母屬的酵母等微生物能天然產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素[3]。

類(lèi)胡蘿卜素對(duì)人和動(dòng)物具有很重要的功效，如它能有效促進(jìn)免疫應(yīng)答，能清除氧自由基，能通過(guò)一系列反應(yīng)生成維生素A[4]。動(dòng)物自身不能生成類(lèi)胡蘿卜素，必須從食物中攝取，比如可將類(lèi)胡蘿卜素添加到飼料中被動(dòng)物獲取，鮭魚(yú)就是如此[5]。人類(lèi)也是從食物中攝取類(lèi)胡蘿卜素，一般水果、蔬菜和有色動(dòng)物類(lèi)食品中含豐富類(lèi)胡蘿卜素。

類(lèi)胡蘿卜素有天然品和人工合成品兩類(lèi)[6]，可以人工合成，也可以從水果、蔬菜中提取。與這些方法比較，利用微生物進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素生產(chǎn)更具優(yōu)勢(shì)，首先不受地理環(huán)境和季節(jié)氣候約束，其次發(fā)酵過(guò)程利用的底物低價(jià)普遍，生產(chǎn)成本低廉[3]。微生物中酵母更優(yōu)于霉菌和藻類(lèi)，適合大型類(lèi)胡蘿卜素生產(chǎn)。酵母多為單細(xì)胞生物，培養(yǎng)簡(jiǎn)單[7]，且生產(chǎn)效率高。目前國(guó)內(nèi)很多學(xué)者將目光聚焦在紅酵母上，紅酵母生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素也越來(lái)越得到廣泛應(yīng)用，但學(xué)者們主要圍繞如何將紅酵母破壁以及如何優(yōu)化類(lèi)胡蘿卜素的提取方法，如何得到高產(chǎn)菌株等展開(kāi)研究，而對(duì)如何促進(jìn)紅酵母的發(fā)酵，如其中培養(yǎng)基的底物組分等還未透徹研究。

本試驗(yàn)設(shè)置若干個(gè)碳氮比，通過(guò)單因素研究實(shí)驗(yàn)探究碳氮比對(duì)試驗(yàn)菌株類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度與細(xì)胞生物量的影響，以及碳氮比的改變對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成過(guò)程中葡萄糖利用、殘?zhí)潜取㈩?lèi)胡蘿卜素得率的影響，探究分析得到試驗(yàn)菌株發(fā)酵產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的最適碳氮比，為類(lèi)胡蘿卜素增產(chǎn)提供參考。

1 不同碳氮比影響的試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

1）試驗(yàn)菌株。由蘋(píng)果皮分離獲得，保存于廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室[8]的黏性紅酵母 （Rhodotorula mucilaginosa）WP3。

2）試驗(yàn)試劑。國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的分析純葡萄糖；廣東臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司生產(chǎn)的分析純NH4NO3；上海賽弗生物科技有限公司生產(chǎn)的純度99%以上的類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品；試驗(yàn)中還用到其他分析純?cè)噭?/p>

3）培養(yǎng)基。一是斜面培養(yǎng)基：稱(chēng)取20 g 蛋白胨，10 g 酵母粉，20 g 瓊脂，20 g 葡萄糖，補(bǔ)水至1 000 mL，pH 值為自然狀態(tài)。二是MS3 培養(yǎng)基：稱(chēng)取1.5 g 酵母粉，30 g 葡萄糖，1 g KH2PO4，5 g NH4NO3，0.4 g NaCl，0.4 g MgSO4·7H2O，加自來(lái)水至1 000 mL[9]。三是MS3-2 培養(yǎng)基：稱(chēng)取30 g 葡萄糖，1.5 g 酵母粉，1 g KH2PO4，0.4 g NaCl，0.4 g MgSO4·7H2O，加自來(lái)水至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)儀器

麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司的DMB5Motic 數(shù)碼顯微鏡；常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)的JJ200 電子天平；廣西壯族自治區(qū)醫(yī)療器械廠(chǎng)的LRH-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱；梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司的AB104-N 電子分析天平；上海智城分析儀器制造有限公司的HWY-2112 全溫度恒溫調(diào)速搖床柜；廣西南寧融儀實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的XB-K-25 血球計(jì)數(shù)板；上海美普達(dá)儀器有限公司的UV-1100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1）保藏菌種。按配方進(jìn)行斜面培養(yǎng)基配制，加熱溶解分裝到試管并滅菌，趁熱將試管傾斜放置，擺出適度的斜面，將試驗(yàn)菌株用滅菌接種環(huán)在斜面 “Z”字劃線(xiàn)，在恒溫28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，保藏于4 ℃冰箱，為了保持菌株活力，一個(gè)月轉(zhuǎn)接一次[10]。

2）培養(yǎng)種子。在150 mL 錐形瓶中裝50 mL 的MS3 培養(yǎng)基，取一環(huán)生命力旺盛的斜面種子接種于其中，搖床條件設(shè)置為30 ℃，150 r/min[11]，將種子液置于其中培養(yǎng)3 d，用滅菌移液槍吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至內(nèi)含MS3 培養(yǎng)基50 mL、容量為150 mL 的錐形瓶中，相同條件的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，取培養(yǎng)液離心去上清，將所得細(xì)胞加無(wú)菌水混勻，將種子液細(xì)胞計(jì)數(shù)，讓接種量一致達(dá)到107個(gè)/mL。

3）搖瓶發(fā)酵。用滅菌移液槍吸取定量種子液轉(zhuǎn)接至內(nèi)含培養(yǎng)液300 mL 的500 mL 錐形瓶中，接種量為107個(gè)/mL，搖床條件設(shè)置為30 ℃，150 r/min，發(fā)酵液置于其中培養(yǎng)7 d，設(shè)置3 組平行試驗(yàn)[12]。

4）測(cè)定生物量。將發(fā)酵液搖勻，使細(xì)胞分散均勻，將其放入離心機(jī)，去上清，細(xì)胞沉淀加與上清液等量的蒸餾水重懸，將此細(xì)胞液通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)其波長(zhǎng)在600 nm 處的吸光度值A(chǔ)600nm[13]。

5）計(jì)算比生長(zhǎng)速率。比生長(zhǎng)速率即單位質(zhì)量的菌體量增加值與時(shí)間的比值，是微生物生長(zhǎng)快慢的參數(shù)之一，也是發(fā)酵動(dòng)力學(xué)中的重要參數(shù)，計(jì)算公式[14]為

式中：μ 為一段時(shí)間內(nèi)的比生長(zhǎng)速率，h-1；N1和N0分別為當(dāng)培養(yǎng)到t1和t0時(shí)測(cè)出的試驗(yàn)菌株的細(xì)胞密度，也就是細(xì)胞液的吸光度值A(chǔ)600nm。

6）提取類(lèi)胡蘿卜素的方法。將發(fā)酵7 d 的培養(yǎng)液量取20 mL 于6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行5 min 離心，除去上清液得到細(xì)胞沉淀，沉淀多次水洗，向沉淀中加入5 mol/L 鹽酸4 mL，持續(xù)振蕩1 h，放入沸水中水浴4 min，通過(guò)離心將鹽酸除去，多次水洗沉淀，將丙酮加入細(xì)胞沉淀，充分振蕩均勻，通過(guò)離心將上清液收集到棕色瓶中，這個(gè)步驟重復(fù)幾次，一直到丙酮液不顯色，混合幾次收集的丙酮液作為提取液，在分液漏斗中加入石油醚 （60～90 ℃沸程），將提取液轉(zhuǎn)移其中，為了避免乳化慢慢滴加超純水，應(yīng)用分層去除丙酮，去除水層，重復(fù)4 次此步驟，一直到丙酮層無(wú)色，得到的石油醚抽提物就是類(lèi)胡蘿卜素提取液[15]。

7）測(cè)定類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度的方法。測(cè)量石油醚抽提物在450 nm 最大吸收波長(zhǎng)處吸光度值[16]，公式[15]為

式中：ρ 為類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，μg/L；A 為提取液在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度；V 為石油醚抽提物總體積，mL；A 為消光系數(shù)，指在450 nm 最大吸收波長(zhǎng)處的光線(xiàn)在透過(guò)光徑為1 cm、內(nèi)裝質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的比色杯時(shí)的吸光度值，計(jì)算3 次平行的均值；P 為用來(lái)提取類(lèi)胡蘿卜素的發(fā)酵液體積，L。

2 不同碳氮比影響的試驗(yàn)結(jié)果

為了探究碳氮比對(duì)紅酵母發(fā)酵的影響，將MS3-2 培養(yǎng)基作為基底，使NH4NO3與葡萄糖質(zhì)量濃度不同 （見(jiàn)第66 頁(yè)表1），pH 值為自然狀態(tài)，選用500 mL 錐形瓶加入300 mL 培養(yǎng)基，將WP3 種子接入培養(yǎng)基，使接種量為107個(gè)/mL，搖床條件設(shè)置為30 ℃，150 r/min，將發(fā)酵液置于其中培養(yǎng)7 d。每24 h 進(jìn)行取樣測(cè)定葡萄糖質(zhì)量濃度與生物量，培養(yǎng)7 d 后取樣進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度的測(cè)定。

2.1 不同碳氮比對(duì)細(xì)胞生物量等的影響

觀察第66 頁(yè)圖1 可以發(fā)現(xiàn)菌株WP3 在0～1 d內(nèi)生物量快速增加，說(shuō)明菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可能為期間某段時(shí)間，細(xì)胞生長(zhǎng)到3 d 以后生物量變化趨于平穩(wěn)，說(shuō)明3 d 后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。培養(yǎng)到第4 d 生物量出現(xiàn)下降，接著慢慢開(kāi)始回升，說(shuō)明生長(zhǎng)后期菌株胞體部分自溶，進(jìn)入衰亡期。

表1 試驗(yàn)中設(shè)置的不同碳氮比 （g/L）

圖1 不同碳氮比對(duì)黏性紅酵母WP3 生物量的影響

隨著碳氮比改變，菌株生物量出現(xiàn)不一致變化。碳氮比為20n 及120c 時(shí)，菌株生長(zhǎng)不好，培養(yǎng)7 d 生物量只有5.52 和5.44，而平均比生長(zhǎng)速率也只有0.013 6 h-1和0.012 9 h-1，這表明葡萄糖和氮源質(zhì)量濃度過(guò)高對(duì)菌株生長(zhǎng)有抑制作用；菌株生長(zhǎng)最好時(shí)的碳氮比為20c 及120n，培養(yǎng)7 d 生物量已達(dá)6.64 和6.82，平均比生長(zhǎng)速率為0.014 4 h-1和0.014 2 h-1；而碳氮比為 70c 和 70n 時(shí)，7 d 后生物量為6.63 和6.21，平均比生長(zhǎng)速率為0.013 7 h-1和0.013 5 h-1。盡管碳氮比為20n 時(shí)，最大比生長(zhǎng)速率已達(dá)0.076 4 h-1，比20c 時(shí)大，但從總體上看仍然比20c 生長(zhǎng)差，這表明葡萄糖質(zhì)量濃度適當(dāng)及碳氮比適當(dāng)促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)。由于碳氮比為120n 時(shí)，所需葡萄糖遠(yuǎn)超于20c，而細(xì)胞生長(zhǎng)差異并不明顯，因此最利于菌株WP3 生長(zhǎng)的碳氮比為20c。BRAUNWALD T 等[17]探究菌株生長(zhǎng)時(shí)碳氮比的影響，觀察到菌株前48 h 生長(zhǎng)情況大體相同。碳氮比為20c 時(shí)，由于碳源含量不高，早期就被消耗，后期細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，碳氮比為20n 時(shí)獲得最高的生物量，這和本實(shí)驗(yàn)碳氮比為20c 時(shí)后期細(xì)胞生長(zhǎng)有所下降一致，但本實(shí)驗(yàn)碳氮比為120n 時(shí)，發(fā)酵7 d后獲得最高的生物量。碳氮比較小時(shí)，因碳源缺乏，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定影響[18]。

從圖1 和圖2 觀察到碳氮比為120c 時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最差，碳氮比為20c 時(shí)最利于細(xì)胞生長(zhǎng)，說(shuō)明葡萄糖質(zhì)量濃度過(guò)高對(duì)菌株生長(zhǎng)起到抑制作用，而碳氮比為120n 與120c 時(shí)，獲得最低類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度，分別為 251.897 0 μg/L 和 252.861 3 μg/L，表明合成類(lèi)胡蘿卜素一定程度上與菌株生長(zhǎng)相關(guān)，類(lèi)胡蘿卜素為次級(jí)代謝產(chǎn)物[19]。碳氮比為70c 時(shí)，獲得最高類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度，為399.466 3 μg/L，因此最利于類(lèi)胡蘿卜素合成的碳氮比為70c。ELBANNA A A 等[20]探究類(lèi)胡蘿卜素合成時(shí)碳氮比的影響，得出最利于類(lèi)胡蘿卜素合成的碳氮比為10，但本研究將碳氮比最小設(shè)置為20。LATHA B V 等[21]探究出40∶1 為最適碳氮比，不同于本試驗(yàn)。

圖2 不同碳氮比對(duì)類(lèi)胡蘿卜素含量的影響

2.2 不同碳氮比對(duì)菌株發(fā)酵過(guò)程的影響

觀察圖3 可以發(fā)現(xiàn)，碳氮比為20c 時(shí)經(jīng)過(guò)4 d發(fā)酵葡萄糖消耗趨于平穩(wěn)，殘?zhí)侵挥?.79 g/L，但其余碳氮比由于葡萄糖質(zhì)量濃度較高，且沒(méi)有有機(jī)氮源的加入，因此發(fā)酵7 d 后剩余殘?zhí)潜容^多。將葡萄糖含量控制在約57 g 時(shí)，不管設(shè)置多少的碳氮比，葡萄糖的消耗大致相同。由此可見(jiàn)，紅酵母進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素合成不能添加過(guò)高的糖量，不然造成消耗糖不充分，糖的利用降低，導(dǎo)致資源浪費(fèi)。BRAUNWALD T 等[17]探究碳氮比對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度變化的影響，得出碳氮比為20c 時(shí)初始葡萄糖質(zhì)量濃度低，發(fā)酵后為低消耗率，但96 h 后葡萄糖已基本消耗。不同碳氮比葡萄糖初始質(zhì)量濃度約57 g/L時(shí)，葡萄糖消耗情況同步，這個(gè)結(jié)論與本試驗(yàn)一樣。而碳氮比為120c 時(shí)由于最初48 h 高葡萄糖消耗緩慢，因此之后葡萄糖消耗情況也相近。

圖3 不同碳氮比對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度變化的影響

觀察第67 頁(yè)圖4 發(fā)現(xiàn)碳氮比為20c 時(shí)葡萄糖消耗較徹底，但還是有較高的殘?zhí)潜?，高?0%，可能是由于培養(yǎng)基沒(méi)有有機(jī)氮源的加入，只簡(jiǎn)單地加入無(wú)機(jī)氮源硝酸銨，因而葡萄糖利用率不高。碳氮比為70c 時(shí)得到最大類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度，但同時(shí)剩下較高殘?zhí)橇?，殘?zhí)潜燃s為80%。改善類(lèi)胡蘿卜素合成的辦法是碳氮比選取70c，適當(dāng)添加有機(jī)氮源，使培養(yǎng)基更營(yíng)養(yǎng)豐富，利于發(fā)酵，葡萄糖利用更充分，便于合成更多的類(lèi)胡蘿卜素。

圖4 不同碳氮比對(duì)殘?zhí)潜鹊挠绊?/p>

2.3 不同碳氮比對(duì)類(lèi)胡蘿卜素得率的影響

圖5 的類(lèi)胡蘿卜素得率指的是類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度與初始葡萄糖質(zhì)量濃度的比值[22]，數(shù)量級(jí)統(tǒng)一為10-6。圖5 中碳氮比為70c 時(shí)得到最大類(lèi)胡蘿卜素得率，達(dá)34.190×10-6，表明單位質(zhì)量濃度的葡萄糖合成類(lèi)胡蘿卜素最多，即合成最多類(lèi)胡蘿卜素用了最低的碳源成本，而碳氮比為120c 時(shí)得到最小類(lèi)胡蘿卜素得率，只有11.391×10-6，表明紅酵母發(fā)酵糖質(zhì)量濃度不宜過(guò)高。綜上所述，培養(yǎng)基不宜加入過(guò)高質(zhì)量濃度的糖，否則抑制菌株的生長(zhǎng)以及類(lèi)胡蘿卜素的合成。

圖5 不同碳氮比對(duì)類(lèi)胡蘿卜素得率的影響

3 結(jié)論

本研究主要探討碳氮比對(duì)試驗(yàn)菌株類(lèi)胡蘿卜素發(fā)酵的影響，圍繞生物量、類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度、殘?zhí)潜?、發(fā)酵得率5 個(gè)量開(kāi)展研究，結(jié)論如下：碳氮比為20c 時(shí)最利于細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)碳氮比為70c 時(shí)最利于類(lèi)胡蘿卜素合成，類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量為399.466 3 μg/L，其得率 （對(duì)初總糖）也最大，為34.190×10-6，但這個(gè)碳氮比葡萄糖利用不完全，發(fā)酵剩余大量殘?zhí)牵蕴嫉冗x擇70c。為了使葡萄糖利用充分，可適當(dāng)添加有機(jī)氮源，利于最大量合成類(lèi)胡蘿卜素。