滋養(yǎng)細胞不僅是妊娠建立和維持的物質(zhì)基礎，也是母-胎界面特殊的固有免疫細胞，多種妊娠疾病均與滋養(yǎng)細胞功能障礙密切相關。滋養(yǎng)細胞的免疫識別功能使胎盤形成一個高效的免疫學屏障，以抵抗病原微生物子宮內(nèi)感染和垂直傳播[1]。人胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞表達多種固有免疫識別受體[2～4]，滋養(yǎng)細胞通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），識別病原微生物的脂多糖、磷壁酸、RNA 或DNA等病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），進而激活固有免疫應答，限制或清除病原感染，同時誘導高效、特異的適應性免疫反應，發(fā)揮重要的免疫屏障功能[5，6]。已有研究指出，滋養(yǎng)細胞可通過TLR3、TLR7/8、RIG-I 識別病原微生物釋放的RNA 成分[7，8]，但滋養(yǎng)細胞能否識別病原體來源的雙鏈DNA 尚不明確，其識別后活化的下游信號通路與胎盤免疫學屏障功能的關系仍有待闡明。為深入探討胎盤滋養(yǎng)細胞在識別胞內(nèi)雙鏈DNA 和妊娠免疫保護中的作用，本研究以人滋養(yǎng)細胞系為研究對象，探討滋養(yǎng)細胞中胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體的表達模式，分析滋養(yǎng)細胞感受雙鏈DNA 刺激后的免疫應答反應，為進一步探索病原體DNA-滋養(yǎng)細胞DNA 受體識別信號在妊娠免疫保護中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVneo、人絨毛膜癌細胞株JEG3、JAR、BeWo（中國科學院深圳先進技術(shù)研究院張鍵教授、范秀軍教授饋贈）；poly（dA：dT）、轉(zhuǎn)染試劑LyoVec以及Nec-1（Necrostatin-1）、z-VAD-fmk[Z-Val-Ala-Asp（OMe）-fluoromethyl ketone] 和Belnacasan（VX-765）（InvivoGen公司）；Trizol試劑（Sigma公司）；RT-PCR試劑（TakaRa 公司）；RT-PCR 引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測DNA識別受體表達 為明確人胎盤滋養(yǎng)細胞胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體的表達模式，經(jīng)半定量PCR 檢測分析胞內(nèi)IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70、LRRFIP1 和ZBP1/DAI 基因的表達情況。參照Trizol 試劑說明書提取人滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo的總RNA，各取2μg 總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master 試劑進行檢測，同時以GAPDH 作為內(nèi)參，相關基因和引物序列見表1。

表1 基因和引物序列

1.2.2 雙鏈DNA 刺激介導滋養(yǎng)細胞死亡 利用人工合成的不同濃度雙鏈DNA 模擬物poly（dA：dT）刺激人絨毛膜癌細胞系JEG3，以相同劑量的LyoVec作為對照，分為6組：空白對照組、LyoVec 對照組、1μg/ml poly（dA：dT）處理組、2μg/ml poly（dA：dT）處理組、5μg/ml poly（dA：dT）處理組和10μg/ml poly（dA：dT）處理組；刺激24h 后，結(jié)晶紫染色實驗和MTT 法檢測JEG3 細胞活性。為明確雙鏈DNA 誘導的滋養(yǎng)細胞死亡方式，首先分別利用細胞凋亡抑制劑z-VAD-fmk（25μM）、細胞焦亡抑制劑VX-765（10μM）或程序性壞死抑制劑Nec-1（25μM）預先處理JEG3 細胞1h，隨后轉(zhuǎn)染5μg/ml的poly（dA：dT）誘導24h 后MTT 法檢測細胞存活情況。

1.2.3 MTT 法檢測細胞活性 待檢測細胞經(jīng)過分組后，每孔分別加入20μl MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，充分振蕩10min，以空白對照孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀490nm 波長處測量各孔的吸光值（OD值）。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 滋養(yǎng)細胞表達多種胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體RT-PCR 結(jié)果表明，4 株滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo 均可檢測到IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 mRNA的表達，但未檢測到ZBP1/DAI的基因表達，見圖1。

圖1 滋養(yǎng)細胞胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體的表達模式

2.2 胞內(nèi)雙鏈DNA刺激可誘導滋養(yǎng)細胞死亡利用MTT實驗檢測細胞存活情況，結(jié)果顯示1μg/ml poly（dA：dT）不影響滋養(yǎng)細胞的存活；2μg/ml、5μg/ml 和10μg/ml的poly（dA：dT）可顯著促進滋養(yǎng)細胞死亡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。結(jié)果表明人胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞能夠感受胞內(nèi)雙鏈DNA 刺激并介導免疫應答反應，同時胞內(nèi)雙鏈DNA 能夠以劑量依賴的方式誘導滋養(yǎng)細胞死亡。

圖2 MTT實驗檢測細胞存活情況

2.3 滋養(yǎng)細胞感受胞內(nèi)雙鏈DNA刺激后介導多種程序性細胞死亡 結(jié)果顯示，Nec-1 對poly（dA：dT）誘導的滋養(yǎng)細胞死亡無明顯影響（P＞0.05）；z-VADfmk 和VX-765 處理能夠顯著抑制poly（dA：dT）誘導的滋養(yǎng)細胞死亡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。結(jié)果表明雙鏈DNA 誘導滋養(yǎng)細胞發(fā)生細胞凋亡和細胞焦亡，但不介導程序性壞死。

圖3 poly（dA：dT）聯(lián)合程序性細胞死亡特異性抑制劑對JEG3 細胞的影響

3 討論

在母-胎界面，胎盤對病原體感染的固有免疫反應是通過PRRs 識別病原體源性成分而啟動的。不同的病原相關分子模式被識別后產(chǎn)生的信號級聯(lián)反應，因參與的模式識別、組織分布和細胞類型不同而產(chǎn)生不同的宿主免疫應答[9]。已知胎盤滋養(yǎng)細胞表達TLR1-10 受體[10]、NLRP3[11]、NOD1 和NOD2[12]等多種固有免疫識別受體，本研究進一步明確了滋養(yǎng)細胞表達包括IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 在內(nèi)的多種胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體。機體被病原體感染后可激活固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，從而活化NF-κB 或I型干擾素信號[13]，介導炎癥反應或促進被感染細胞死亡，以限制或清除病原體感染[14]。本研究證實了滋養(yǎng)細胞感受胞內(nèi)雙鏈DNA 刺激后能夠誘導免疫應答反應，并以劑量依賴的方式誘導細胞死亡。

固有免疫系統(tǒng)作為機體抵御病原微生物入侵的第一道防線，通過模式識別受體識別病原相關分子模式后，可誘導被感染細胞發(fā)生程序性死亡，這種主動的細胞死亡被認為對病原體是有害的，是機體對病原體感染的一種免疫防御機制[15]。細胞凋亡是伴隨Caspase 活化的程序性細胞死亡，細胞凋亡時維持膜的完整性，不會迅速釋放胞內(nèi)物質(zhì)，細胞解體前被吞噬細胞吞噬，通常不引起炎癥反應；此外，細胞凋亡介導的吞噬作用刺激機體產(chǎn)生白介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）以抑制炎癥反應，因此一般認為細胞凋亡是維持細胞穩(wěn)態(tài)所需的免疫沉默過程，對機體是有益的。細胞焦亡通常由炎性小體所介導，模式識別受體（如NLRP3、AIM2 等）識別病原相關分子模式或損傷相關分子模式后，通過接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-Caspase-1），當pro-Caspase-1的局部濃度升高時，發(fā)生自體剪切，生成具有生物活性的Caspase-1[16，17]。 Caspase-1 可剪切細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，使其成熟并釋放到胞外介導炎癥反應，表現(xiàn)為細胞膜崩解，胞質(zhì)內(nèi)毒素釋放，趨化炎癥細胞促進其釋放細胞因子，啟動宿主免疫反應，也是機體重要的固有免疫反應，在抵抗病原感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。

程序性壞死是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細胞死亡方式，受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）去除泛素化修飾后，以FADD 作為橋梁與Caspase-8 和RIP3 形成胞內(nèi)多蛋白復合體，當Caspase-8 活化時誘導細胞發(fā)生凋亡；而當Caspase-8 活化障礙時，RIPK1 和RIPK3 清除障礙并磷酸化，導致壞死體形成增加，從而導致細胞發(fā)生程序性壞死。與細胞凋亡和焦亡相比，程序性壞死沒有Caspase 活化，不形成凋亡小體并且呈現(xiàn)壞死樣結(jié)構(gòu)[18]。細胞程序性壞死導致細胞膜完整性喪失，釋放的胞內(nèi)物質(zhì)使PRRs對PAMPs 敏感性升高，促進炎癥反應和感染性疾病的惡化，顯示出細胞死亡有害的一面[19]。本研究證實人工合成的雙鏈DNA 模擬物刺激滋養(yǎng)細胞系JEG3 后所介導的細胞死亡，可被Caspase 抑制劑z-VAD-fmk 和Caspase-1 特異性抑制劑部分逆轉(zhuǎn)，但此細胞死亡方式不受程序性壞死特異性抑制劑Nec-1 影響。Nec-1 作用于RIP1 激酶活性，能特異性地阻斷非Caspase 依賴的細胞死亡，對細胞凋亡和細胞焦亡沒有抑制作用。

綜上所述，滋養(yǎng)細胞胞內(nèi)表達多種雙鏈DNA感受器，外界的DNA 刺激滋養(yǎng)細胞后主要介導的細胞死亡方式是Caspase 依賴的細胞凋亡和細胞焦亡，并不誘導細胞發(fā)生程序性壞死。子宮內(nèi)感染過程中病原來源的雙鏈DNA 可作為病原相關分子模式被胞內(nèi)雙鏈DNA識別受體識別，進而激活固有免疫應答，誘導細胞死亡，限制或清除病原感染，以抵御病原微生物入侵。因此，深入探討胎盤滋養(yǎng)細胞雙鏈DNA識別的活化機制，將有助于揭示病原體DNA-滋養(yǎng)細胞DNA 受體識別信號在妊娠免疫保護中抵抗病原微生物子宮內(nèi)感染和垂直傳播的作用。