梁杰，張崇淼，朱聰聰，姬智乙，張佩佩，蘇露馨

西安建筑科技大學(xué)，陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710055

人工湖作為現(xiàn)代城市的重要組成部分，不僅能增加水汽循環(huán)、調(diào)節(jié)區(qū)域氣候，而且其景觀娛樂(lè)功能也隨著人們生活水平的提高顯得愈發(fā)重要[1]。地表水因取用方便，水質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是人工湖的主要補(bǔ)給水源，但這對(duì)于缺水城市來(lái)說(shuō)卻是沉重的負(fù)擔(dān)[2]。隨著水資源供需矛盾的日益加劇以及污水再生處理技術(shù)的日臻完善，再生水作為城市人工湖的補(bǔ)給水源逐漸受到青睞[3-4]。北京奧林匹克公園的龍形水系[5]、天津生態(tài)濕地公園[6]和昆明的翠湖[7]都是再生水應(yīng)用于城市人工湖的典型代表。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，城市地表水體可能是細(xì)菌耐藥性傳播的重要媒介[8-9]。城市人工湖耐藥菌污染狀況不僅關(guān)系到生態(tài)環(huán)境，也在一定程度上影響著社會(huì)公眾的身體健康[10]。然而，目前我國(guó)在城市人工湖細(xì)菌耐藥性污染方面的研究還處于起步階段，污染特征和內(nèi)在規(guī)律尚不甚清楚[11]。使用地表水和再生水作為補(bǔ)給水源，對(duì)人工湖的細(xì)菌耐藥特性以及耐藥菌多樣性會(huì)產(chǎn)生何種影響，是否會(huì)造成差異化的結(jié)果，這些問(wèn)題都亟待闡明。

本研究選取分別以地表水和再生水補(bǔ)水的2處人工湖為研究對(duì)象，通過(guò)長(zhǎng)期取樣檢測(cè)，系統(tǒng)考察了人工湖中總異養(yǎng)菌群對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥狀況，并對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥表型分析和種屬鑒定。以期揭示不同補(bǔ)給水源對(duì)人工湖中細(xì)菌耐藥性和耐藥菌種屬分布的影響，為城市水環(huán)境中細(xì)菌耐藥性傳播控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 水樣采集

選擇西安市的XQ湖和FQ湖為研究對(duì)象，這2處人工湖坐落于西安市主城區(qū)的2處公園內(nèi)，具有景觀和娛樂(lè)功能。XQ湖水面積約1.0×105m2，平均水深2 m，地表水是其補(bǔ)水來(lái)源，F(xiàn)Q湖水面面積約4.0×104m2，平均水深1.5 m，使用再生水補(bǔ)水。2018年4—11月，對(duì)這2處人工湖逐月進(jìn)行水樣采集。使用1 L水樣采集器在水面下大約0.5 m處采樣，每個(gè)人工湖設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，采集5 L混合水樣，置于預(yù)先滅菌的聚乙烯瓶中，在6 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室分析。

1.2 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.3 異養(yǎng)菌和耐藥菌含量測(cè)定

使用濾膜法對(duì)水樣中的異養(yǎng)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]。將水樣梯度稀釋后，真空抽濾通過(guò)0.45 μm孔徑的混合纖維素濾膜，將濾膜細(xì)菌截留面向上緊密貼在PCA培養(yǎng)平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)菌落數(shù)量為20～200的培養(yǎng)平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，每次檢測(cè)做2個(gè)平行樣。使用菌落數(shù)量的平均值計(jì)算出每100 mL水樣中的異養(yǎng)菌數(shù)量。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI 2017)標(biāo)準(zhǔn)[14]，在PCA平板中分別加入氨芐西林(AMP)、磺胺甲惡唑(SMZ)和四環(huán)素(TET)制備出AMP、SMZ和TET抗性平板，其中相應(yīng)抗生素質(zhì)量濃度分別為32、512和16 μg·mL-1。類似地，使用濾膜法測(cè)定水樣中的耐藥菌，計(jì)算得到水樣中AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌和TET耐藥菌的含量。

1.4 菌株分離純化與耐藥表型檢測(cè)

隨機(jī)挑取PCA平板上的菌落，平板劃線進(jìn)行分離純化。采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定其是否為耐藥菌。3種藥敏紙片中的抗生素含量為：AMP，10 μg·片-1；SMZ，300 μg·片-1；TET，30 μg·片-1。使用大腸埃希氏菌ATCC25 922作為質(zhì)控菌株。將分離所得的耐藥菌逐一編號(hào)，菌株編號(hào)上的“XQ”和“FQ”代表其來(lái)源人工湖。

1.5 菌株種屬鑒定

針對(duì)分離菌株中的耐藥菌，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，TaKaRa公司)提取總DNA。選擇通用引物27 F 5’-AGAGTTTGAT-CCTGGCTCAG-3’和1492 R 5’-GGTTACCTTGTT-ACGACTT-3’，以及516 F 5’-TGCCAGCAGCCG-CGGTA-3’和1510 R 5’-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3’，使用梯度PCR儀(Veriti型，美國(guó)Applied Biosystem公司)對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15-16]，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(JY300C型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)初步判定，然后送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。使用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)其種屬。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS Statistics 18.0軟件對(duì)常規(guī)理化指標(biāo)、總異養(yǎng)菌群含量、耐藥菌含量和分離出的耐藥菌比例進(jìn)行均值比較、相關(guān)性分析。用MEGA 7軟件對(duì)耐藥菌株中的氣單胞菌屬進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 人工湖水體的常規(guī)理化指標(biāo)

2.2 人工湖中總異養(yǎng)菌及耐藥菌含量

表1 XQ湖和FQ湖常規(guī)理化指標(biāo)的t檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 The t-test results for conventional physical and chemical indicators in XQ Lake and FQ Lake

圖1 人工湖中總異養(yǎng)菌和耐藥菌含量注：AMP表示氨芐西林，SMZ表示磺胺甲惡唑，TET表示四環(huán)素。Fig. 1 Total heterotrophic bacteria and antibiotic-resistant bacteria concentration in artificial lakesNote: AMP stands for ampicillin; SMZ stands for sulfamethoxazole; TET stands for tetracycline.

2.3 分離菌株的耐藥表型

從XQ湖和FQ湖分別分離出61株和60株異養(yǎng)菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，XQ湖中的AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌和TET耐藥菌的數(shù)量分別為37、11和9；FQ湖中這3種耐藥菌的數(shù)量分別為42、11和5。顯然，這2處人工湖分離菌株中的AMP耐藥菌比例都較高(60.7%和70.0%)，而TET耐藥菌則占比較低(14.8%和8.3%)，這與2處人工湖總異養(yǎng)菌群中AMP耐藥菌和TET耐藥菌含量高低狀況基本吻合。對(duì)XQ湖和FQ湖每月分離出的3種耐藥菌株檢出率進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)它們存在顯著性差異(P>0.05)。

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，AMP、SMZ和TET分別歸屬于β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素，它們的抗菌機(jī)制各不相同：AMP主要是抑制菌體細(xì)胞壁的合成，SMZ抑制細(xì)菌葉酸合成過(guò)程中的二氫蝶酸合酶，TET則是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)繁殖[19]。從XQ湖和FQ湖共分離出84株耐藥菌，產(chǎn)生了5種耐藥表型。如表2所示，對(duì)AMP單一耐藥的占比高達(dá)71.4%，遠(yuǎn)高于其他表型；其次為AMP-SMZ-TET，占比14.3%；AMP-SMZ和SMZ單一耐藥的占比都僅為6.0%；AMP-TET的最少，只有2.4%。由此可見(jiàn)，這2處人工湖中異養(yǎng)菌的耐藥表型比較集中，對(duì)AMP單一耐藥是其最主要的耐藥表型。

2.4 耐藥菌株的種屬鑒定

分離出的84株耐藥菌在生物分類學(xué)上歸屬于19個(gè)種。其中，XQ湖耐藥菌39株，12個(gè)種；FQ湖耐藥菌45株，12個(gè)種。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)和鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultella ornithinolytica)是2個(gè)湖共有的耐藥菌(圖2)。

從XQ湖分離的AMP耐藥菌共有10個(gè)種，主要是蠟狀芽孢桿菌，占比為54.1%；SMZ耐藥菌和TET耐藥菌分別有8個(gè)種和5個(gè)種，主要種屬是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和大腸埃希氏菌。從FQ湖分離出的AMP耐藥菌有10個(gè)種，蠟狀芽孢桿菌仍是主要菌株，占比54.8%；SMZ耐藥菌和TET耐藥菌分別有8個(gè)種和4個(gè)種，主要為維氏氣單胞菌和大腸埃希氏菌。一些研究表明，從臨床和食物中分離出的蠟狀芽孢桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素具有高度耐藥性[20]，但對(duì)其他多種抗生素都敏感[21]。這與本研究從人工湖中分離出的蠟狀芽孢桿菌的耐藥特性近似。

對(duì)照已知的固有耐藥菌譜[14]，可以發(fā)現(xiàn)從XQ湖和FQ湖中分離得到了一些對(duì)AMP的固有耐藥菌，包括肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，但它們?cè)诜蛛x菌株中的占比均不超過(guò)10%。這2處人工湖分離出的菌株中均不存在對(duì)SMZ或TET的固有耐藥菌。

結(jié)合上述耐藥性異養(yǎng)菌群測(cè)定結(jié)果分析可知，獲得性耐藥很可能是城市人工湖中細(xì)菌耐藥性的主要來(lái)源。很多研究都表明，人類活動(dòng)對(duì)細(xì)菌耐藥性的傳播有重要貢獻(xiàn)，在污水、地表水，甚至飲用水中都發(fā)現(xiàn)了多種抗生素抗性基因[22-23]。此外，基因水平轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)在微生物群落中普遍存在，胞內(nèi)DNA和胞外DNA都在細(xì)菌間的耐藥性傳播中發(fā)揮著重要作用[24-25]。XQ湖的補(bǔ)給水源為地表水，其在輸送過(guò)程中流經(jīng)村莊及農(nóng)田時(shí)不可避免地會(huì)有耐藥菌和耐藥基因匯入，最終進(jìn)入XQ湖；FQ湖的補(bǔ)給水源為再生水，其由城市污水經(jīng)深度處理所得，亦含有數(shù)量可觀的耐藥菌和耐藥基因[26]。耐藥菌進(jìn)入湖水后生長(zhǎng)繁殖會(huì)增加這類耐藥菌的數(shù)量；耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移會(huì)擴(kuò)大耐藥菌的種屬分布范圍，二者都會(huì)導(dǎo)致人工湖總異養(yǎng)菌群耐藥率的提高。此外，在XQ湖和FQ湖中分離出的耐藥菌株中，大部分屬于條件致病菌，有些在臨床和環(huán)境樣品中都經(jīng)常檢出，例如氣單胞菌、葡萄球菌等。這在一定程度上也反映了人類活動(dòng)與環(huán)境之間的交互作用。

圖2 人工湖中分離的耐藥菌株種屬Fig. 2 Species of antibiotic-resistant strains isolated from artificial lakes

表2 XQ湖和FQ湖分離菌株的耐藥表型Table 2 Antibiotic resistance phenotypes of isolates strains from XQ Lake and FQ Lake

2.5 耐藥性氣單胞菌的聚類分析

氣單胞菌屬在環(huán)境中分布非常廣泛，是水環(huán)境中的主要耐藥菌群之一[27]。從XQ湖和FQ湖中共分離出16株耐藥性氣單胞菌，分別歸屬于維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。通過(guò)聚類分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖3)，可以發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)豚鼠氣單胞菌16S rDNA序列的相似性極高。相比嗜水氣單胞菌，維氏氣單胞菌與豚鼠氣單胞菌的關(guān)系更疏遠(yuǎn)，分離出的維氏氣單胞菌在進(jìn)化樹(shù)中的親緣關(guān)系也更為復(fù)雜。這些氣單胞菌中有10株僅對(duì)AMP耐藥，1株(FQ80901)僅對(duì)SMZ耐藥，5株(XQ81001、FQ81003、FQ81001、FQ81004和FQ80903)對(duì)AMP和SMZ二重耐藥。從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，除了屬于豚鼠氣單胞菌的FQ80903之外，其余4株二重耐藥菌都是維氏氣單胞菌，處在相近的分支上?？傮w來(lái)看，維氏氣單胞菌耐藥譜較為多樣，而豚鼠氣單胞菌耐藥表型較單一。值得注意的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)分離來(lái)源對(duì)這些耐藥性氣單胞菌的聚類有明顯影響，例如FQ80903、FQ80705、XQ81004和XQ805-2-01，盡管來(lái)自2處不同的人工湖，但它們?cè)谶M(jìn)化樹(shù)中都在同一分支；也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)某種來(lái)源的氣單胞菌具有明顯的耐藥性聚類特征。

圖3 耐藥性氣單胞菌屬進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of antibiotic-resistant Aeromonas

綜上所述：

(1)XQ湖和FQ湖中AMP耐藥菌、SMZ耐藥菌含量約為102～104CFU·(100 mL)-1，TET耐藥菌含量約為101～103CFU·(100 mL)-1。2個(gè)湖共分離出84株耐藥菌，71.4%都是對(duì)AMP單一耐藥。蠟狀芽孢桿菌是主要的AMP耐藥菌。

(2)從XQ湖和FQ湖分離出的耐藥菌歸屬于19個(gè)種，其中蠟狀芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、維氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和鳥氨酸拉烏爾菌為2個(gè)湖共有耐藥菌。僅有不足10%的細(xì)菌對(duì)AMP具有固有耐藥性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)SMZ和TET具有固有耐藥性的菌種。獲得性耐藥很可能是城市人工湖中細(xì)菌耐藥性的主要來(lái)源。

(3)地表水補(bǔ)水的XQ湖和再生水補(bǔ)水的FQ湖在總異養(yǎng)菌含量、耐藥菌含量和檢出率上均無(wú)顯著差異。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，分離來(lái)源對(duì)16株耐藥性氣單胞菌的聚類并無(wú)明顯影響。