徐吉洋，張文萍，李少南

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310058

農(nóng)藥產(chǎn)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)主要取決于2個(gè)方面：一是農(nóng)藥產(chǎn)品在環(huán)境介質(zhì)中沉積量和沉積范圍，二是其對(duì)非靶生物的危害。出于經(jīng)濟(jì)和時(shí)效方面的考慮，農(nóng)藥危害鑒定試驗(yàn)?zāi)壳按蠖喾植襟E、分層次進(jìn)行。如果初評(píng)能夠排除農(nóng)藥產(chǎn)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，試驗(yàn)過程即可終止；反之則需要開展高層次試驗(yàn)[1-3]。方法之一是擴(kuò)大物種測(cè)量范圍，構(gòu)建物種敏感度分布(SSD)曲線[4-5]。SSD曲線的使用無疑會(huì)降低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中“假陰性”結(jié)論的出現(xiàn)概率。然而SSD曲線賴以建立的基礎(chǔ)是依據(jù)個(gè)體試驗(yàn)。眾所周知，以個(gè)體試驗(yàn)的結(jié)果來評(píng)判農(nóng)藥在種群或群落層次的危害，其結(jié)論往往并不可靠。正如按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD)制定的OECD 202[6]開展溞類急性毒性試驗(yàn)而得到的48-h EC50難以被用來判斷農(nóng)藥在種群層次的危害，更談不上對(duì)相關(guān)的群落演替的影響。OECD 202中的48 h試驗(yàn)[6]如此，OECD 211中的21 d試驗(yàn)[7]同樣如此，可見對(duì)于初評(píng)呈“陽性”的農(nóng)藥產(chǎn)品，開展種群或群落試驗(yàn)十分必要。

在種群或群落層次開展農(nóng)藥危害性測(cè)試，需要建立相應(yīng)的系統(tǒng)。這就涉及物種的選擇。筆者嘗試構(gòu)建包含隆線溞(Daphnia carinata)、鋸緣真劍水蚤(Eucyclops serrulatus)和中華薄殼介(Dolerocypris sinensis) 3種甲殼動(dòng)物當(dāng)中的1種或全部，以及包含小球藻(Chlorella vulgaris)、萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)和輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)的4組測(cè)試系統(tǒng)。溞、劍水蚤、介形蟲和輪蟲之所以被選用，主要是因?yàn)樗鼈儠r(shí)常出現(xiàn)在同一水域[8-10]，藻可以作為食物被上述浮游動(dòng)物當(dāng)中的部分或全部物種所取食[11-13]，水草可以抑制藻在測(cè)試系統(tǒng)內(nèi)過度生長(zhǎng)[14]。本研究選擇有機(jī)磷殺蟲劑毒死蜱作為受試農(nóng)藥。毒死蜱應(yīng)用范圍廣，其對(duì)淡水測(cè)試系統(tǒng)的影響已有不少研究[15-21]，是考察農(nóng)藥直接和間接效應(yīng)的理想化學(xué)品。本研究的主要目的包括：(1)了解物種構(gòu)成對(duì)于淡水測(cè)試系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響；(2)了解物種構(gòu)成不同的測(cè)試系統(tǒng)在抗農(nóng)藥脅迫能力上的差別。

殼二糖酶(chitobiase)編號(hào)EC 3.2.1.52，又被稱為?-N-乙酰己糖胺糖苷酶(?-N-acetylhexosaminidase)，或被稱為N-乙酰氨基葡萄糖胺糖苷酶(N-acetylglucosaminidase)，是有能力水解?-1,4-糖苷鍵(?-1,4-glycosidic bonds)的酶類。節(jié)肢動(dòng)物在生長(zhǎng)過程中需要經(jīng)歷多次脫皮，脫皮過程需要?dú)ざ敲傅膮⑴c[22]。水生節(jié)肢動(dòng)物在每次脫皮之后會(huì)將其富含殼二糖酶的脫皮液釋放到水中，動(dòng)物個(gè)體越大數(shù)量越多，單位時(shí)間內(nèi)釋放到水中的殼二糖酶的量就越多[23-25]。Duchet等[26]和Qi等[27]分別研究了多殺菌素、除蟲脲和吡蟲胍對(duì)溞類種群殼二糖酶釋放量的影響，結(jié)果顯示，隨著農(nóng)藥對(duì)種群的壓制，介質(zhì)中殼二糖酶的比活性也有所下降。筆者將游離態(tài)殼二糖酶作為一項(xiàng)測(cè)量指標(biāo)，希望探明其作為農(nóng)藥種群脅迫指示因子的功效。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試農(nóng)藥

毒死蜱(chlorpyrifos)，化學(xué)名稱為O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，由浙江新農(nóng)化工有限公司提供，純度97%。

1.2 受試物種

本文所涉及的隆線溞(Daphnia carinata)屬于溞科(以下簡(jiǎn)稱溞water fleas)、鋸緣真劍水蚤(Eucyclops serrulatus)屬于劍水蚤科(以下簡(jiǎn)稱劍水蚤cyclops)、中華薄殼介(Dolerocypris sinensis)屬于金星介科(以下簡(jiǎn)稱介形蟲seed shrimps)、萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)(以下簡(jiǎn)稱輪蟲rotifers)以及(羅氏)輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)均采自浙江大學(xué)華家池校區(qū)人工池塘。溞和輪蟲用小球藻飼養(yǎng)，劍水蚤和介形蟲用輪蟲飼養(yǎng)。小球藻(Chlorella vulgaris)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)并按其提供的配方營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 測(cè)試系統(tǒng)構(gòu)成和組建

采用能夠容納2 L稀釋液的玻璃燒杯。施藥前26 d將輪葉黑藻植入試驗(yàn)容器。水草取莖尖以下約7 cm，先植入25 mL小燒杯。小燒杯底部鋪上1 cm厚的泥炭。上面覆蓋3 cm厚的石英砂(30目)。每1只小燒杯植入1株水草。每只試驗(yàn)容器內(nèi)放3只植入水草的小燒杯。以O(shè)ECD M4營(yíng)養(yǎng)液作為稀釋水。配方參見OECD211中附件2[7]。其中，除了CaCl2、MgSO4、KCl和NaHCO3，微量元素的濃度是原配方的3倍。植入水草的同時(shí)(施藥前26 d)將稀釋水引入試驗(yàn)容器。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知系統(tǒng)中氮、磷濃度隨著時(shí)間的延續(xù)呈下降趨勢(shì)，因此自施藥前23 d開始，每隔3 d向每只試驗(yàn)容器內(nèi)補(bǔ)充濃度為1 200 mg·L-1的KH2PO4和濃度為7 000 mg·L-1的KNO3各0.5 mL。共構(gòu)建4組測(cè)試系統(tǒng)。前3組系統(tǒng)當(dāng)中只包含1種節(jié)肢動(dòng)物。第4組同時(shí)包含溞、劍水蚤和介形蟲。

給藥前18 d接種小球藻(接種密度約105cells·mL-1)。給藥前7 d接種浮游動(dòng)物。輪蟲接種密度為0.35 只·mL-1(相當(dāng)于每只試驗(yàn)容器接種約700只)。給藥前4 d接種節(jié)肢動(dòng)物。溞、介形蟲和劍水蚤每只試驗(yàn)容器各接種25只。分別從施藥前6 d和3 d開始向第4組測(cè)試系統(tǒng)內(nèi)補(bǔ)充藻和輪蟲，每隔3 d向每只試驗(yàn)容器內(nèi)補(bǔ)充1 mL濃度為7×106cells·mL-1的藻液，每隔3 d向每只試驗(yàn)容器內(nèi)補(bǔ)充700只。

1.4 溫度和光照

將系統(tǒng)置于溫度24～27 ℃和光照強(qiáng)度3 500～2 200 lx條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每日光照16 h。

1.5 給藥

試驗(yàn)共設(shè)1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)濃度組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)于“溞”系統(tǒng)，毒死蜱添加濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、2.5和12.5 μg·L-1，對(duì)于其他3組測(cè)試系統(tǒng)，毒死蜱添加濃度分別為0、0.05、0.25、1.25、6.25和31.25 μg·L-1。由于受試農(nóng)藥水溶解度有限，先用丙酮將其溶解配成初級(jí)母液，再用丙酮將初級(jí)母液稀釋成系列濃度的次級(jí)母液。用微量注射器量取初級(jí)或次級(jí)母液50 μL加入各試驗(yàn)容器。

1.6 采樣

使用美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials, ASTM)制定的ASTM E 1366-02中推薦的柱狀取水器采集水樣[28]。每只試驗(yàn)容器每次采樣100 mL。采樣規(guī)程如表1所示。試驗(yàn)容器內(nèi)因采樣和揮發(fā)而損失的稀釋液用無離子水加以補(bǔ)充。

用270目濾網(wǎng)濾除浮游動(dòng)物，剩下的水樣過0.22 μm醋酸纖維素濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)，供水質(zhì)指標(biāo)和殼二糖酶活性測(cè)量之用。

1.7 樣品測(cè)量

1.7.1 浮游動(dòng)物

隆線溞以及體型較大的介形蟲和劍水蚤肉眼可見，輪蟲以及體型較小介形蟲和劍水蚤肉眼難以分辨。鑒于此，借助體視顯微鏡(日本Nikon，SMZ1500)和浮游動(dòng)物計(jì)數(shù)框(德國(guó)HYDRO-BIOS，435 010)對(duì)于水樣內(nèi)浮游動(dòng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)。為減少對(duì)測(cè)試系統(tǒng)的干擾，計(jì)數(shù)后的浮游動(dòng)物及水樣盡量返還。

表1 采樣規(guī)程Table 1 Sampling schedule

注：1)以施藥當(dāng)天作為0 d。

Note:1)To take date of pesticide application as 0 d.

1.7.2 水質(zhì)指標(biāo)

被測(cè)量的水質(zhì)指標(biāo)包括pH、電導(dǎo)率、總氮、總磷、銨態(tài)氮(NH4-N)和濁度。pH測(cè)量采用GB 6920—1986的方法[29]；電導(dǎo)率測(cè)量采用DZ/T 0064.6—93的方法[30]；總磷測(cè)量采用GB/T 11893—1989的方法[31]；總氮測(cè)量采用GB/T 11894—1989的方法[32]；NH4-N測(cè)量采用GB/T 7479—1987的方法[33]；濁度測(cè)量采用GB 13200—91的方法[34]。

1.7.3 殼二糖酶

以4-甲基傘形酮N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-?-D-glucosaminide, MUF-NAG)作為底物，采用熒光分光光度法進(jìn)行測(cè)量[35]。具體方法如下：向96孔聚苯乙烯板中加入150 μL經(jīng)過0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾后的水樣(作為酶源)，加入50 μL含0.31 mmol·L-1MUF-NAG的0.15 mol·L-1檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH=5.5)，在25 ℃下溫育1 h，用50 μL 0.25 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)。作為空白，向水樣中同時(shí)加入底物和NaOH，其余步驟同前。采用熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)MD，GEMINI xps)在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下測(cè)量酶的產(chǎn)物發(fā)出的熒光。用水解產(chǎn)物4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone, MUF)建立標(biāo)準(zhǔn)方程。將測(cè)量結(jié)果帶入方程求出單位體積水樣在單位時(shí)間內(nèi)生成MUF的量。

1.7.4 水草

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將輪葉黑藻取出，測(cè)量其主根和主莖長(zhǎng)度，對(duì)于側(cè)根和側(cè)莖進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后稱量濕重并加以記錄。

1.8 數(shù)據(jù)處理

單變量分析(包括回歸分析和差異顯著性分析)采用DPS?[36]；多變量分析采用排序軟件CANOCO 5的主成份分析(principal component analysis, PCA)模塊[37]。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 浮游動(dòng)物

浮游動(dòng)物在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)如圖1、圖2和圖3所示。圖4顯示上述浮游動(dòng)物在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)。從圖1、圖2和圖3中可以看出，浮游動(dòng)物在3組測(cè)試系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)各有不同：溞先升后降，介形蟲持續(xù)上升，劍水蚤先升后降然后再上升。從圖4中可以看出，節(jié)肢動(dòng)物在該系統(tǒng)中先上升然后保持相對(duì)平穩(wěn)。輪蟲在該系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)也是先升后降，但是下降速度較圖1、圖2和圖3緩慢。

以浮游動(dòng)物的群密度作為應(yīng)變量，以受試農(nóng)藥添加濃度作為解釋變量，對(duì)數(shù)據(jù)組做PCA，結(jié)果如圖5所示。從解釋變量和應(yīng)變量箭頭在圖5中的走向上看，毒死蜱對(duì)各系統(tǒng)中溞、介形蟲和劍水蚤的影響均為負(fù)，對(duì)輪蟲的影響則并不一致。以單個(gè)物種為目標(biāo)做PCA，結(jié)果顯示，毒死蜱在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)中對(duì)輪蟲的影響均為負(fù)(影響率分別為<0.1%、0.5%和0.2%)；在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中，毒死蜱對(duì)輪蟲的影響為正(影響率為35.1%)。

圖1 “溞”系統(tǒng)內(nèi)的隆線溞(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～12.5 μg·L-1)的種群動(dòng)態(tài)注：圖中每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 1 State of D. carinata (a) and B. calyciflorus (b) in “water flea” systems being exposed to chlorpyrifos (0～12.5 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

圖2 “介形蟲”系統(tǒng)內(nèi)的中華薄殼介(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動(dòng)態(tài)注：圖中每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 2 State of D. sinensis (a) and B. calyciflorus (b) in “seed shrimp” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

圖3 “劍水蚤”系統(tǒng)內(nèi)的鋸緣真劍水蚤(a)和萼花臂尾輪蟲(b)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動(dòng)態(tài)注：圖中每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 3 State of E. serrulatus (a) and B. calyciflorus (b) in “cyclop” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

2.2 水質(zhì)指標(biāo)

pH、電導(dǎo)率、總氮、總磷、NH4-N和濁度等6項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)在“溞”、“介形蟲”、“劍水蚤”和“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中的變化趨勢(shì)分別如圖6、圖7、圖8和圖9所示。在4組測(cè)試系統(tǒng)中，總氮、總磷和濁度總體呈下降趨勢(shì)(總磷在有些系統(tǒng)的中間過程中有波動(dòng))，電導(dǎo)率總體呈上升趨勢(shì)，pH變化不大(在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中，該指標(biāo)有上升趨勢(shì))，NH4-N前升后降(在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中的下降不充分)。

為鑒定農(nóng)藥對(duì)上述6項(xiàng)指標(biāo)的影響，以單項(xiàng)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果作為應(yīng)變量，以受試農(nóng)藥添加濃度作為解釋變量，對(duì)數(shù)據(jù)組做PCA，結(jié)果如表2所示。就影響性質(zhì)而言，毒死蜱在各系統(tǒng)之間具有相似性；就指標(biāo)而言，毒死蜱促進(jìn)了系統(tǒng)內(nèi)pH、NH4-N和電導(dǎo)率水平的上升以及總氮、總磷和濁度水平的下降。這在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中尤為明顯。

2.3 水草

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)內(nèi)各株輪葉黑藻的生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)量。以測(cè)量結(jié)果作為應(yīng)變量，以受試農(nóng)藥添加濃度作為解釋變量，對(duì)數(shù)據(jù)組做PCA，結(jié)果如圖10所示。從圖10中可以看出，除了濕重，農(nóng)藥對(duì)大部分生長(zhǎng)指標(biāo)(主根、主莖、側(cè)根和側(cè)莖)有負(fù)面影響，農(nóng)藥對(duì)濕重的影響在系統(tǒng)之間有所差異。

圖4 “多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)內(nèi)的浮游動(dòng)物在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的種群動(dòng)態(tài)注：圖中每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 4 State of zooplanktons in “multi-arthropod” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

表2 針對(duì)水質(zhì)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果的非限制性排序Table 2 Unconstrained ordination for result of measurements for selected water-quality indexes

注：1)“+”表示解釋變量對(duì)應(yīng)變量有正面影響，“-”表示解釋變量對(duì)應(yīng)變量有負(fù)面影響；2)“Ⅰ”表示溞+輪蟲測(cè)試系統(tǒng)，“Ⅱ”表示介形蟲+輪蟲測(cè)試系統(tǒng)，“Ⅲ”表示劍水蚤+輪蟲測(cè)試系統(tǒng)，“Ⅳ”表示多節(jié)肢動(dòng)物+輪蟲測(cè)試系統(tǒng)。

Note:1)“+” means a positive impact of supplementary variable(s) on response variable; “-” means a negative impact of supplementary variable(s) on response variable;2)“Ⅰ” means water flea+rotifer test system; “Ⅱ” means seed shrimp+rotifer test system; “Ⅲ” means cyclop+rotifer test system; “Ⅳ” means multi-arthropod+rotifer test system.

2.4 殼二糖酶

殼二糖酶在4組測(cè)試系統(tǒng)中的比活性變化趨勢(shì)如圖11所示?？梢钥闯觯瑲ざ敲傅谋然钚栽凇皽小毕到y(tǒng)中先升后降，在“介形蟲”系統(tǒng)中持續(xù)上升，在“劍水蚤”系統(tǒng)中先升后降然后再上升，在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中先上升然后保持相對(duì)平穩(wěn)。這與節(jié)肢動(dòng)物在圖1～圖4中的變化有相似之處。以浮游動(dòng)物在水體中的豐度作為應(yīng)變量，以游離態(tài)殼二糖酶比活性作為解釋變量，對(duì)數(shù)據(jù)組做PCA，結(jié)果如圖12所示。可以看出，殼二糖酶與節(jié)肢動(dòng)物之間的協(xié)同關(guān)系比較明顯，與輪蟲之間的協(xié)同關(guān)系不明顯。

圖5 毒死蜱對(duì)浮游動(dòng)物的影響注：X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值代表坐標(biāo)軸的相對(duì)長(zhǎng)度；X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值絕對(duì)值越大，變量的變化率越大；括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)表示解釋變量引起的變化在應(yīng)變量總變化中所占的比例。Fig. 5 The effects of chlorpyrifos on zooplanktonsNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables.

圖6 “溞”系統(tǒng)內(nèi)部分水質(zhì)指標(biāo)在毒死蜱暴露下(0～12.5 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 6 Change in some water quality indexes in “water flea” systems being exposed to chlorpyrifos (0～12.5 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

3 討論(Discussions)

3.1 農(nóng)藥對(duì)生物指標(biāo)的影響

3.1.1 浮游動(dòng)物

PCA結(jié)果顯示，本研究中建立的“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)能夠揭示毒死蜱對(duì)于輪蟲的誘導(dǎo)。這種誘導(dǎo)在野外發(fā)生的頻率很高[15-17]。根據(jù)現(xiàn)有資料，溞和輪蟲之間存在食物競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[38-39]，劍水蚤和輪蟲之間存在捕食與被捕食關(guān)系[40-41]，同樣的關(guān)系也存在于介形蟲和輪蟲之間[42]。可以設(shè)想在作為食物競(jìng)爭(zhēng)者的溞和作為捕食者的介形蟲和劍水蚤受到毒死蜱壓制的情形下，輪蟲得到一定程度的恢復(fù)。在“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)中，輪蟲因受到溞、介形蟲和劍水蚤的高強(qiáng)度壓制而過快下降，其恢復(fù)潛力得不到正常發(fā)揮。這提示，維持測(cè)試系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)于農(nóng)藥效應(yīng)，特別是間接效應(yīng)的測(cè)量十分重要。本研究的結(jié)果顯示，在維持穩(wěn)定方面“多介質(zhì)動(dòng)物”系統(tǒng)優(yōu)于“溞”、“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)。

對(duì)于圖5對(duì)應(yīng)的各組系統(tǒng)，提取后臺(tái)數(shù)據(jù)CaseR.1(即應(yīng)變量在第1軸上的分值)，對(duì)它們?cè)诟魈幚斫M之間的差異做多重比較，結(jié)果如表3所示。

注：1)每組用“/”隔開的字母(或字母組合)顯示對(duì)6個(gè)處理所對(duì)應(yīng)的CaseR.1(即樣品在第1軸上的分值)做多重比較的結(jié)果；6個(gè)處理分別是CK、0.05、0.25、1.25、6.25和31.25 μg·L-1。以相同字母(或全部或部分相同的字母組合)代表的CaseR.1被視為相同(即P≥0.01)，以不同字母(或完全不同的字母組合)所代表的CaseR.1被視為不同(即P<0.01)；與CK不同的標(biāo)為灰色；2)NOEC為最高無作用濃度，LOEC為最低有效濃度；以連續(xù)2次不同于對(duì)照作為L(zhǎng)OEC成立的前提[43]，括號(hào)中的數(shù)值表示效應(yīng)持續(xù)的時(shí)間。

Note:1)Each group of letter (or letter combination) separated by “/” indicated a result of multiple comparison of CaseR.1 (i.e. sample score at the first axon) corresponding to six treatments, i.e. CK, 0.05, 0.25, 1.25, 6.25 and 31.25 μg·L-1; the values of CaseR.1 represented by same letter (or letter combination of the same or partly the same) are considered the same statistically (i.e. P≥0.01), whereas the values of CaseR.1 represented by different letter (or letter combination totally different) are statistically different (i.e. P<0.01); the CaseR.1 that was different from CK are painted grey;2)NOEC means maximal no observed effect concentration; LOEC means lowest observed effect concentration; the LOEC could not be recognized unless it lasted for a period of two successive times or more[43]; that enclosed in the brackets were the time lasting for the effect.

圖7 “介形蟲”系統(tǒng)內(nèi)部分水質(zhì)指標(biāo)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 7 Change in some water quality indexes in“seed shrimp” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

從表3中可以看出，在“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)中，對(duì)于“介形蟲+輪蟲”和“劍水蚤+輪蟲”組合，在給藥之后(2～35 d)采集60個(gè)樣品，其中分別有14個(gè)和9個(gè)不同于對(duì)照；在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中，對(duì)于相應(yīng)的組合，在給藥之后(2～32 d)采集60個(gè)樣品，其中分別有23個(gè)和18個(gè)不同于對(duì)照?？梢娫诟惺芏舅莉缑{迫方面，“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)比“介形蟲”和“劍水蚤”系統(tǒng)更靈敏。此處未對(duì)“多節(jié)肢動(dòng)物”和“溞”系統(tǒng)中的“溞+輪蟲”組合進(jìn)行比較，原因是溞和輪蟲在2個(gè)系統(tǒng)中的受脅迫水平不同(它們分別是0、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μg·L-1和0、0.05、0.25、1.25、6.25、31.25 μg·L-1)。

作為一種應(yīng)用廣泛的殺蟲劑，有關(guān)毒死蜱對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)及浮游動(dòng)物影響的研究較多。Daam等[16]在室外測(cè)得毒死蜱對(duì)浮游動(dòng)物群落(包含3種溞、7種輪蟲、劍水蚤(未分類)、哲水蚤(未分類)、介形蟲(未分類)、橈足類無節(jié)幼蟲和原生動(dòng)物(砂殼蟲))的LOEC為100 μg·L-1；López-Mancisidor等[17]在室外測(cè)得毒死蜱對(duì)枝角類(8種)、橈足類(3種)、輪蟲(24種)的LOEC分別為1 μg·L-1；可見兩者之間存在差異。在室內(nèi)，Daam和van den Brink[44]測(cè)得毒死蜱對(duì)浮游動(dòng)物群落(包含6種溞、11種輪蟲、介形蟲(未分類)、劍水蚤(未分類)和昆蟲(蜉蝣))的LOEC為0.05 μg·L-1；van Wijngaarden等[45]測(cè)得毒死蜱對(duì)包含2種溞、3種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤、橈足類無節(jié)幼蟲、纖毛蟲、太陽蟲的“地中海”群落，對(duì)包含4種溞、11種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤的“溫帶”群落，以及對(duì)包含7種溞、5種輪蟲以及哲水蚤、劍水蚤、橈足類無節(jié)幼蟲的另一“地中?！比郝涞腖OEC均為1 μg·L-1。表3顯示毒死蜱對(duì)浮游動(dòng)物群落(包含溞、介形蟲、劍水蚤和輪蟲)的LOEC為1.25 μg·L-1，可見本研究所構(gòu)建的“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)抗農(nóng)藥脅迫能力適中。

圖8 “劍水蚤”系統(tǒng)內(nèi)部分水質(zhì)指標(biāo)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 8 Change in some water quality indexes in “cyclop” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

3.1.2 水草

本研究的4組測(cè)試系統(tǒng)中均接種了輪葉黑藻。一是防止單細(xì)胞藻類在試驗(yàn)過程中可能出現(xiàn)的過度生長(zhǎng)[14]，二是為介形蟲之類的浮游動(dòng)物提供適宜生長(zhǎng)的環(huán)境[46]。有關(guān)殺蟲劑對(duì)水草影響的研究目前鮮有報(bào)道。在陸生植物方面，人們發(fā)現(xiàn)如毒死蜱這樣的殺蟲劑能夠影響綠豆(Vigna radiata)植株的氮代謝[47]并有可能引起植株的氧化損傷[48]。Bertrand等[49]以屬于沼生目(Helobiae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)的小眼子菜(Potamogeton pusillus)作為受試植物，測(cè)量毒死蜱對(duì)植株抗氧化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在極低濃度(3.5～94.5 ng·L-1)之下即可引起植株抗氧化反應(yīng)。在本研究中，筆者僅測(cè)量了水草在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的生長(zhǎng)情況，并未測(cè)量水草在試驗(yàn)過程中的變化，因此無法確定毒死蜱對(duì)水草的影響閾值。鑒于水草在維持系統(tǒng)穩(wěn)定方面的重要性，其抗農(nóng)藥脅迫能力理應(yīng)得到人們的關(guān)注，這方面還需要更加細(xì)致的研究。

3.2 農(nóng)藥對(duì)水質(zhì)指標(biāo)的影響

作為一種應(yīng)用廣泛的殺蟲劑，已有不少研究考察了毒死蜱對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)的影響，包括對(duì)于水質(zhì)指標(biāo)的影響。然而正如表4所示，這些研究的結(jié)果似乎并不一致。PCA結(jié)果顯示，毒死蜱對(duì)于測(cè)試系統(tǒng)內(nèi)pH和NH4-N水平的上升以及總氮和總磷水平的下降有促進(jìn)作用(表2)。其中，NH4-N的上升可能與浮游動(dòng)物在農(nóng)藥脅迫下對(duì)NH4-N釋放量增加有關(guān)[50-51]。pH升高的現(xiàn)象在以往研究中也有報(bào)道，這預(yù)示系統(tǒng)內(nèi)的光合作用得到毒死蜱的促進(jìn)[18,44-45]。二嗪農(nóng)[18]這樣的殺蟲劑有類似功效，莠去津[43]和利谷隆[52]這樣的除草劑則相反?？紤]到水質(zhì)變化的生態(tài)學(xué)意義，有關(guān)農(nóng)藥對(duì)水質(zhì)的影響，今后還應(yīng)深入研究。

圖9 “多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)內(nèi)部分水質(zhì)指標(biāo)在毒死蜱暴露下(0～31.25 μg·L-1)的變化注：圖中的每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值。Fig. 9 Change in some water quality indexes in“multi-arthropod” systems being exposed to chlorpyrifos (0～31.25 μg·L-1)Note: Each spot in the figures represented average of three measurements.

表4 有關(guān)毒死蜱影響測(cè)試系統(tǒng)水質(zhì)的文獻(xiàn)研究結(jié)果1)Table 4 Reports from previous researchers concerning impacts of chlorpyrifos on quality of water in test systems 1)

注：1)“+”表示正面影響；“-”表示負(fù)面影響；“0”表示無影響；“/”表示未測(cè)量。

Note:1)“+” means a positive impact; “-” means a negative impact; “0” means no impact; “/” means not measured.

圖10 毒死蜱對(duì)輪葉黑藻的影響注：X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值代表坐標(biāo)軸的相對(duì)長(zhǎng)度；X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值絕對(duì)值越大，變量的變化率越大；括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)表示解釋變量引起的變化在應(yīng)變量總變化中所占的比例。Fig. 10 The effects of chlorpyrifos on Hydrilla verticillataNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables.

圖11 測(cè)試系統(tǒng)中游離態(tài)殼二糖酶在毒死蜱暴露下的比活性變化注：圖中的每1個(gè)點(diǎn)代表3個(gè)測(cè)定結(jié)果的平均值；(a)為“溞”系統(tǒng)，給藥濃度0～12.5 μg·L-1；(b)為“介形蟲”系統(tǒng)，給藥濃度0～31.25 μg·L-1；(c)為“劍水蚤”系統(tǒng)，給藥濃度0～31.25 μg·L-1；(d)為“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)，給藥濃度0～31.25 μg·L-1。Fig. 11 Change in specific activity of free-living chitobiase in systems being exposed to chlorpyrifosNote: Each spot in the figures represented average of three measurements; (a) represents “water flea” systems, with administrative concentrations of 0～12.5 μg·L-1; (b) represents “seed shrimp” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1; (c) represents “cyclop” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1; (d) represents “multi-arthropod” systems, with administrative concentrations of 0～31.25 μg·L-1.

3.3 殼二糖酶

表2右起第1列顯示“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)內(nèi)各處理組殼二糖酶比活性差異多重比較結(jié)果。從中可以看出，毒死蜱對(duì)酶指標(biāo)的最高無作用濃度(NOEC)和最低有效濃度(LOEC)分別為0.25和1.25 μg·L-1，LOEC延續(xù)時(shí)間>32 d，這與計(jì)數(shù)獲得的結(jié)果(表2右起第2列)比較一致，說明酶指標(biāo)能夠用來指示農(nóng)藥對(duì)浮游動(dòng)物群落的影響閾值。

為量化殼二糖酶與節(jié)肢動(dòng)物之間的協(xié)同關(guān)系，筆者仍以“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)為例，以殼二糖酶比活性作為解釋變量，以肢動(dòng)物豐度作為應(yīng)變量制作散點(diǎn)圖并且建立回歸方程，結(jié)果分別如圖13和表5所示。從點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的角度，自變量與應(yīng)變量之間存在協(xié)同關(guān)系(圖13(a))。方程A的R2=0.7563，F(xiàn)=330.5602，P=0.0000。從時(shí)段對(duì)時(shí)段的角度，自變量與應(yīng)變量之間的協(xié)同關(guān)系明顯改善(圖13(b))。方程B的R2=0.9655，F(xiàn)=209.9833，P=0.0000。

節(jié)肢動(dòng)物在生長(zhǎng)過程中不斷向水中釋放酶，被釋放的酶又不斷被降解。如果種群處于平衡狀態(tài)，酶的釋放率與降解速率相等。基于這一假設(shè)，人們常以酶在移除節(jié)肢動(dòng)物的水體中的降解率來衡量節(jié)肢動(dòng)物的種群繁殖率[53-55]。也只有在這種狀態(tài)下，酶的比活性才能夠以較小偏差來指示種群豐度。相反如果節(jié)肢動(dòng)物種群處于擴(kuò)張(或萎縮)狀態(tài)，動(dòng)物的豐度會(huì)被高估(或低估)。

從圖4中可以看出，以給藥后第8天為界，之前動(dòng)物大約處于擴(kuò)張狀態(tài)，之后它們趨于穩(wěn)定。為此分別以殼二糖酶比活性和節(jié)肢動(dòng)物豐度在-4～8 d和8～32 d的測(cè)量結(jié)果(平均值)作為解釋變量和應(yīng)變量制作散點(diǎn)圖(圖13(c)和13(d))并得到回歸方程(表5中的方程C和D)。對(duì)比方程B和D，可以看出方程B對(duì)動(dòng)物的豐度有所高估。這正是由于動(dòng)物在前期的擴(kuò)張引起的?？梢娨胩岣邭ざ敲缸鳛檗r(nóng)藥脅迫指示因子的可靠性，所構(gòu)建的測(cè)試系統(tǒng)需要維持穩(wěn)定。

從系統(tǒng)穩(wěn)定性以及系統(tǒng)對(duì)殺蟲劑脅迫的直接和間接反應(yīng)上看，本研究所構(gòu)建的“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)相比只包含1種節(jié)肢動(dòng)物的測(cè)試系統(tǒng)更能夠準(zhǔn)確衡量農(nóng)藥對(duì)浮游動(dòng)物的生態(tài)脅迫。

圖12 浮游動(dòng)物豐度變化與殼二糖酶活性變化的關(guān)系注：X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值代表坐標(biāo)軸的相對(duì)長(zhǎng)度；X和Y軸上所標(biāo)的數(shù)值絕對(duì)值越大，變量的變化率越大；括號(hào)中的百分?jǐn)?shù)表示解釋變量引起的變化在應(yīng)變量總變化中所占的比例；浮游動(dòng)物(節(jié)肢動(dòng)物和輪蟲)在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)內(nèi)的豐度以其在單位體積內(nèi)的生物量(μg·(100 mL)-1)作為衡量依據(jù)，隆線溞、中華薄殼介、鋸緣真劍水蚤和萼花臂尾輪蟲的個(gè)體生物量分別以1.32、0.659、0.0674和0.0473 μg·只-1進(jìn)行計(jì)算；它們?cè)诹硗?個(gè)系統(tǒng)內(nèi)的豐度以種群密度(只·(100 mL)-1)作為衡量依據(jù)。Fig. 12 The relationship between change in abundance of zooplanktons and change in activity of chitobiaseNote: Values marked on the X- and Y-axis indicated relative length of the axes; the larger the absolute value marked on the axes, the larger the change rate of the variables; the percentage in blankets represent portions of variation resulted from explanatory variable to the total variation of response variables; abundances of zooplankton (arthropods and rotifer) were scaled with biomass per volume (μg·(100 mL)-1) in “multi-arthropod” systems; the biomass of D. carinata, D. sinensis, E. serrulatus, and B. calyciflorus was counted as 1.32, 0.659, 0.0674, and 0.0473 μg·individual-1, respectively; those in other three systems were scaled with population density (individuals·(100 mL)-1).

表5 殼二糖酶活性與節(jié)肢動(dòng)物生物量在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)中的協(xié)同關(guān)系Table 5 Correlation between activity of chitobiase and biomass of arthropods in “multi-arthropod” systems

注：1)數(shù)據(jù)來源時(shí)段；2)“x”為殼二糖酶在稀釋液中的比活性(μmol·h-1·L-1)，“y”為節(jié)肢動(dòng)物的單位生物量(mg·(100 mL)-1)；“x”和“y”在方程A中意指-4～32 d之內(nèi)的任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的測(cè)定值，在方程B中意指-4～32 d之內(nèi)12個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的測(cè)定結(jié)果的平均值，在方程C中意指-4～8 d之內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的測(cè)定結(jié)果的平均值，在方程D中意指8～32 d之內(nèi)8個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的測(cè)定結(jié)果的平均值。

Note:1)Time period for collection of the data;2)“x” is activity of chitobiase in dilutions (μmol·h-1·L-1); “y” is biomass of arthropods population in dilutions (mg·(100 mL)-1); either “x” or “y” is a measurement at any point of time from -4 to 32 d in Equation A, an average of measurements at 12 points of time from -4 to 32 d in Equation B, an average of measurements at 5 points of time from -4 to 8 d in Equation C, and an average of measurements at 8 points of time from 8 to 32 d in Equation D.

圖13 殼二糖酶和生物量在“多節(jié)肢動(dòng)物”系統(tǒng)內(nèi)的變化Fig. 13 Change in chitobiase and biomass in “multi-arthropod” systems

致謝：本項(xiàng)研究中的溞和劍水蚤由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王新華教授鑒定，介形蟲由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院禹娜教授鑒定。在此一并致謝！