馬立顯

(延安大學(xué)咸陽醫(yī)院兒童保健科, 陜西 咸陽 712000)

先天性心臟病在臨床較為常見，屬于一種胎兒先天性畸形，活產(chǎn)兒達(dá)到了0.4%～5.0%的發(fā)生率[1]。近年來，在我國，新生兒出生缺陷率日益提升，因此，為了對(duì)先天性心臟病進(jìn)行及時(shí)預(yù)防、診斷與治療，臨床很有必要盡可能快地從分子水平將先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制闡明。遺傳因素、環(huán)境因素等很多因素均會(huì)引發(fā)出生缺陷[2]。研究結(jié)果顯示[3]，兒童先天性心臟病的發(fā)生受到TBX_20基因錯(cuò)義突變的影響。但是，臨床需要澄清中國先天性心臟病患兒等人群中TBX_20的作用。在對(duì)某種疾病的遺傳傾向進(jìn)行探索與鑒定的過程中，單核苷酸多態(tài)性(SNP)評(píng)估是臨床通常采用的方法，通過研究易感基因的SNP，能夠?qū)⒃摶蚝图膊〉南嚓P(guān)性明確下來，從而有效診斷、治療疾病并改善疾病預(yù)后。本研究分析了TBX_(20)基因多態(tài)性和新生兒先天性心臟病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：隨機(jī)選取2016年8月至2018年8月新生兒先天性心臟病患兒40例，其中男性20例，女性20例，日齡5～19d，平均(12.9±2.2)d。在疾病類型方面，4例為法洛四聯(lián)癥，21例為室間隔和房間隔缺損，4例為室間隔和房間隔缺損伴動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，3例為動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，3例為室間隔缺損伴動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，3例為房間隔缺損伴動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，2例為室間隔缺損。將這些患者作為研究組，另選取我院同期接生的健康兒童40例作為對(duì)照組，其中男性20例，女性20例，日齡6～19d，平均(13.5±2.6)d。兩組兒童的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn):研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合先天性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均經(jīng)體格檢查、四維超聲、超聲心動(dòng)圖檢查等確診為先天性心臟??；③家長均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①缺乏完整的臨床資料；②合并其他嚴(yán)重疾??；③無法有效配合研究。對(duì)照組納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：出生5min Apgar評(píng)分為8～10分，心、肝、腎等臟器功能均正常，且家屬對(duì)本研究內(nèi)容知情，配合本研究。排除家屬不同意對(duì)患兒進(jìn)行TBX_(20)基因多態(tài)性研究，或患兒合并重要臟器功能異常。

1.3方 法

1.3.1TBX_20基因SNP預(yù)測與分析:預(yù)測與分析TBX_20 SNP時(shí)應(yīng)用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫，將TBX_20、Homo sapiens等關(guān)鍵詞輸入NCBI網(wǎng)站的dbSNP數(shù)據(jù)庫，共將471個(gè)和人類TBX_20相關(guān)的SNP尋找了出來，有17個(gè)SNP存在于人類TBX_20上。

1.3.2采集血氧與基因組DNA提取:將抗凝劑設(shè)定為檸檬酸鈉，將兩組兒童的5mL靜脈血抽取出來，對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，在此過程中應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒。

1.3.3PCR:將TBX_20第5外顯子基因特異性序列的一對(duì)引物設(shè)計(jì)出來，北京三丸源生物技術(shù)公司合成引物，下游引物為5'-GCCCTGAAACTCAATAGCTC-3'，上游引物為5'-CCTCACTGTAATTTGGCCTG-3'。PCR混合物包含2mL基因組DNA(用作模板)+3.0mL 2.5mmoL每種dNTP混合物+1.0mL Taq DNA聚合酶+2.5mL 25mmoL/L MgCl2+3.0mL 10×PCR緩沖液+1.0mL 12mmoL/L引物1+1.0mL 12mmoL/L 引物2+15mL H2O。PCR條件為96℃、96℃、55℃分別6min、27s、54s，28個(gè)循環(huán)；73℃、75℃分別28s、4min。

1.3.4瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物:在1%瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行觀察，在瓊脂糖凝膠中加入10μL PCR產(chǎn)物+2mL 6X樣品緩沖液，在52mV下進(jìn)行18min的電泳。電泳完成后拍攝照片并保存，在此過程中將凝膠成像系統(tǒng)充分利用起來。對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行初步檢測。

1.3.5PCR產(chǎn)物序列:三輪聯(lián)酶生物技術(shù)公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，比較并分析測序結(jié)果，從而對(duì)TBX_20基因組序列與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳:兩組兒童的260/280值在血液基因組DNA濃度=226～360ng/mL時(shí)均約1.8，說明提取的基因組DNA具有較好的質(zhì)量，可以在PCR擴(kuò)增中應(yīng)用。TBX_20第5個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物大小為350bp，和設(shè)計(jì)引物對(duì)應(yīng)的TBX_20基因相同。無非特異性條帶。XbaI、EcoRI消化限制酶后獲取的TBX_20基因片段類似于理論預(yù)測。

2.2PCR產(chǎn)物測序結(jié)果:正向、反向測序兩組兒童的DNA樣品獲取的測序成功率>99%。

2.3測序結(jié)果比較:比較從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取的TBX_20基因序列和測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者序列同源性達(dá)到99.4%，具有相同的PCR產(chǎn)物。

2.4TBX_20基因的SNP分析結(jié)果:為了對(duì)群體代表性進(jìn)行評(píng)估，基因分型TBX_20基因的PCR產(chǎn)物，同時(shí)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TBX_20基因有SNP位點(diǎn)存在rs3999950：c.774T>C(Ala265Ala)，TBX_20SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。

2.5TBX_20基因的SNP等位基因頻率與基因型頻率:為了對(duì)群體代表性進(jìn)行評(píng)估，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗(yàn)，TBX_20 SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。研究組患兒的rs3999950位點(diǎn)TT、TC基因型頻率分別為35.0%(14/40)、65.0%(26/40)，對(duì)照組患兒的rs3999950位點(diǎn)TT、TC基因型頻率分別為80.0%(32/40)、20.0%(8/40)。研究組患兒的rs3999950位點(diǎn)TC基因型頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且兩組兒童C基因位點(diǎn)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TC基因型OR>1，提升了先天性心臟病發(fā)病率。具體見表1。

表1 兩組兒童rs3999950位點(diǎn)基因分布情況及等位基因占比比較n(%)

注：比較兩組C基因位點(diǎn)、T基因位點(diǎn)時(shí)，以研究組80個(gè)基因位點(diǎn)、對(duì)照組80個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析

3 討 論

現(xiàn)階段，rs3999941、rs6950175是臨床已知的TBX_20 SNP位點(diǎn)。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者通過嚴(yán)格控制與雙盲試驗(yàn)[4]，發(fā)現(xiàn)兒童先天性心臟病和TBX_20多態(tài)性rs3999950具有極為密切的關(guān)系，因此認(rèn)為在兒童先天性心臟病的遺傳易感性相關(guān)因素中，TBX_20多態(tài)性rs3999950占有重要地位。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[5]，新生兒先天性心臟病患兒的rs3888850位點(diǎn)TC基因型頻率顯著高于健康兒童，TC基因的優(yōu)勢比OR>1，C位點(diǎn)頻率等于rs3999950位點(diǎn)，說明先天性心臟病發(fā)生率會(huì)在TC基因型的作用下提升。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[6]，兒童先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展受到TBX_20基因多態(tài)性直接而深刻的影響。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[7]，先天性心臟病和TBX_20多態(tài)性rs3999950具有極為密切的關(guān)系，對(duì)二者的關(guān)系進(jìn)行探討能夠?qū)⒂行б罁?jù)提供給臨床早期發(fā)現(xiàn)、治療先天性心臟病的工作，從而促進(jìn)患兒生活質(zhì)量的有效提升。

本研究為了分析TBX_(20)基因多態(tài)性和新生兒先天性心臟病的關(guān)系，隨機(jī)選取2016年8月至2018年8月新生兒先天性心臟病患兒40例，將這些患者作為研究組，另選取同期我院來自同一家庭的健康兒童40例作為對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)分析兩組兒童rs3999950位點(diǎn)基因分布情況，結(jié)果表明，兩組兒童的260/280值在血液基因組DNA濃度=226～360ng/mL時(shí)均約1.8，說明提取的基因組DNA具有較好的質(zhì)量，可以在PCR擴(kuò)增中應(yīng)用。TBX_20第5個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物大小為350bp，和設(shè)計(jì)引物對(duì)應(yīng)的TBX_20基因相同[8]。無非特異性條帶。XbaI、EcoRI消化限制酶后獲取的TBX_20基因片段類似于理論預(yù)測。正向、反向測序兩組兒童的DNA樣品獲取的測序成功率>99%。比較從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取的TBX_20基因序列和測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者序列同源性達(dá)到99.4%，具有相同的PCR產(chǎn)物。為了對(duì)群體代表性進(jìn)行評(píng)估，基因分型TBX_20基因的PCR產(chǎn)物，同時(shí)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TBX_20SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符，TBX_20基因有SNP位點(diǎn)存在rs3999950：c.774T>C(Ala265Ala)。為了對(duì)群體代表性進(jìn)行評(píng)估，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗(yàn)，TBX_20 SNP分布和Hardy-Weinberg遺傳平衡相符。研究組患兒的rs3999950位點(diǎn)TC基因型頻率顯著高于對(duì)照組，且兩組兒童C基因位點(diǎn)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TC基因型OR>1，提升了先天性心臟病發(fā)病率，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致，說明在先天性心臟病的遺傳易感性因素中，TBX_20基因多態(tài)性占有重要地位。

但是，本研究也有一定的局限性。首先，由于本研究只將40例新生兒先天性心臟病患兒收集了起來，具有較少的病例數(shù)；其次，由于具有較小的隊(duì)列規(guī)模，沒有對(duì)不同類型先天性心臟病進(jìn)行對(duì)比，因此，進(jìn)一步研究應(yīng)該將不同類型先天性心臟病增加其中，從而將先天性心臟病發(fā)生發(fā)展和TBX_20多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)一步提供出來；最后，本研究沒有進(jìn)一步依據(jù)性別、年齡、種族分類。

總之，TBX_(20)基因的SNP位點(diǎn)rs3999950可能和新生兒先天性心臟病的發(fā)生具有密切關(guān)系，值得臨床充分重視。