朱 燁， 陳 燕， 彭 樂(lè)， 江友琴

(江西省人民醫(yī)院, 江西 南昌 330000)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種好發(fā)于老年群體的表現(xiàn)為記憶力衰退、進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙的中樞神經(jīng)疾病，AD已成為全球范圍性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。目前，診斷AD仍以核磁共振(MRI)、X線(xiàn)片掃描結(jié)合患者臨床表現(xiàn)以及神經(jīng)心理學(xué)量表的綜合手段為主，但因?yàn)锳D的潛伏期較長(zhǎng)，故確診時(shí)多已造成神經(jīng)功能損傷[2]。研究表明，APOE基因的表達(dá)與AD發(fā)病密切相關(guān)，且其在不同年齡段中患者的表達(dá)量不同[3]?；诖?，本研究探討了不同年齡分期老年AD患者APOE基因表達(dá)情況，并分析了其與患者認(rèn)知功能障礙之間的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2018年6月至2019年6月我院收治的老年AD患者64例為主要研究對(duì)象，根據(jù)患者發(fā)病年齡分為早發(fā)型AD組(1組，<65歲)、遲發(fā)型AD組(>65歲)，遲發(fā)型AD組又分為老年期組(2組，65～80歲)、高齡期組(3組，80～90歲)、長(zhǎng)壽期組(4組，>90歲)，每組16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病、語(yǔ)言交流障礙及卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke-AD and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)[4]標(biāo)準(zhǔn)；②年齡>60歲；③簡(jiǎn)易智力狀態(tài)量表(Mini-Mental State Examimation,MMSE)評(píng)分≤26分，且臨床癡呆評(píng)定量表(Clinical dementia rating,CDR)評(píng)分≥1分，Hachinski缺血指數(shù)<4分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?lài)?yán)重顱腦損傷史患者；②抗精神疾病藥物依賴(lài)患者；③其他影響中樞神經(jīng)功能疾病患者；④合并嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙患者；⑤合并心、肝、肺、腎等器官?lài)?yán)重功能障礙患者；⑥血液系統(tǒng)疾病患者。1組中男4例，女12例，年齡為60～65歲，平均為(62.63±2.64)歲；2組中男5例，女11例，年齡為66～80歲，平均為(71.85±6.04)歲；3組中男6例，女10例，年齡為81～90歲，平均為(85.89±3.70)歲；4組中男5例，女11例，年齡>90歲，平均(93.89±2.62)。4組患者的性別對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院倫理委員會(huì)同意，患者家屬知情，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法:抽取10mL所有患者清晨空腹?fàn)顟B(tài)外周靜脈血，EDTA管抗凝，2000r/min，離心處理10min，分離出血漿，根據(jù)Hixson等的PCR及限制性?xún)?nèi)切酶APOE基因亞型分型方法，使用紅細(xì)胞裂解液分離剩余所得靜脈血樣本中的白細(xì)胞，用已預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物：上游引物：5'-ACAGAATTCGC-CCCGGCCTGGTACAC-3'，下游引物：5'-TAAGCT-TGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'，PCR反應(yīng)體系：1μg DNA模板、5μL反應(yīng)緩沖液(10倍濃度)、200μmoL/L dNTPs、1.5mmoL/L 氯化鎂(MGCl2)、10 pmoL 上游引物、10p moL下游引物、5μL 二甲基亞砜(10%)，1.5U Taq DNA聚合酶，共50μL。反應(yīng)過(guò)程：95℃，變性，1min→62℃，退火，2min→72℃，延伸，2min，循環(huán)30次后→72℃，延伸，10min，反應(yīng)結(jié)束。取20μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，37℃，置入5U限制性?xún)?nèi)切酶(HhaⅠ)酶進(jìn)行酶切4～5h，酶切位點(diǎn)為GCGC，再行瓊脂糖凝膠電泳，80V，電泳6～8h，再用溴化已定進(jìn)行染色處理，觀(guān)察并記錄電泳分離條帶的數(shù)量及位置，以檢測(cè)APOE的不同基因亞型表達(dá)情況。

1.3觀(guān)察指標(biāo):檢測(cè)4組患者的APOE基因表達(dá)情況，并用簡(jiǎn)易智力狀態(tài)量表(MMSE)、AD認(rèn)知功能評(píng)定量表(ADAS-cog)、AD日常生活能力量表(ADL)綜合評(píng)定患者的認(rèn)知功能障礙程度。其中，MMSE量表包含語(yǔ)言能力、回憶能力、計(jì)算力及注意力、記憶力、定向力等共5個(gè)條目，總分為0～30分，≥27分為正常，<27分為認(rèn)知功能障礙，≤9分為重度認(rèn)知功能障礙，10～20分為中度認(rèn)知功能障礙，21～26分為輕度認(rèn)知功能障礙；ADAS-cog量表包含注意力、找詞能力、回憶測(cè)驗(yàn)指令、定向力、結(jié)構(gòu)性練習(xí)、命名、單次回憶、執(zhí)行指令、意向性練習(xí)、詞語(yǔ)辨認(rèn)、口頭語(yǔ)言表達(dá)、語(yǔ)言理解、等共12個(gè)條目，總分為0～75分，得分越高代表認(rèn)知功能障礙程度越高；ADL量表共20個(gè)條目，總分為20～80分，分值越高代表日常生活能力越差。

2 結(jié) 果

2.14組患者的APOE基因表達(dá)情況比較:結(jié)果表明，4組患者均未出現(xiàn)E2/E2型APOE基因亞型，E3/E3亞型表達(dá)中，1組患者的頻率最高，為62.50%(10/16)，其次為2組患者的43.75%(7/16)，E3/E4亞型表達(dá)中，3組患者頻率最高，為43.75%(7/16)，其次為4組患者的37.50%(6/16)，其余亞型的表達(dá)均較低；APOE共E2/E3/E4 3種等位基因，其中E3的表達(dá)頻率最高，其次為E4，E2表達(dá)頻率最低，見(jiàn)表1。

表1 4組患者的APOE基因表達(dá)情況比較n(%)

注：①表示1組與2組比較檢驗(yàn)值，①P>0.05；②表示2組與3組比較檢驗(yàn)值，②P>0.05；③表示3組與4組比較檢驗(yàn)值，③P>0.05;④表示1組與4組比較檢驗(yàn)值，④P<0.05；⑤表示1組與3組比較檢驗(yàn)值，⑤P>0.05；⑥表示2組與4組比較檢驗(yàn)值，⑥P>0.05

2.24組患者的MMSE、ADAS-cog、ADL評(píng)分情況比較:結(jié)果表明，4組患者的MMSE、ADAS-cog、ADL評(píng)分比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且MMSE評(píng)分中：1組>2組>3組>4組，ADAS-cog評(píng)分中：1組<2組<3組<4組，ADL評(píng)分中：1組<2組<3組<4組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 4組患者的MMSE ADAS-cog ADL評(píng)分情況比較分)

注：①表示1組與2組間比較檢驗(yàn)值，①P<0.05；②表示1組與3組間比較檢驗(yàn)值，②P<0.05；③表示1組與4組間比較檢驗(yàn)值，③P<0.05；④表示2組與3組間比較檢驗(yàn)值，④P<0.05；⑤表示3組與4組間比較檢驗(yàn)值，⑤P<0.05；⑥表示2組與4組間比較檢驗(yàn)值，⑥P<0.05

2.3APOE基因表達(dá)與不同年齡分期AD老年患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系:不同APOE基因亞型患者的MMSE評(píng)分、ADAS-cog評(píng)分、ADL評(píng)分比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩輛組間LSD-t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 APOE基因表達(dá)與不同年齡分期AD老年患者認(rèn)知功能障礙的關(guān)系

注：因E2/E2型亞型均未出現(xiàn)，故不納入統(tǒng)計(jì)，等位基因與基因亞型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相同，故不再贅述.①表示E2/E3型與E2/E4型比較檢驗(yàn)值，①P>0.05；②表示E2/E4型與E3/E3型比較檢驗(yàn)值，②P>0.05；③表示E3/E3型與E3/E4型比較檢驗(yàn)值，③P>0.05；④表示E3/E4型與E4/E4型比較檢驗(yàn)值，④P>0.05；⑤表示E2/E3型與E3/E3型比較檢驗(yàn)值，⑤P>0.05；⑥表示E2/E3型與E3/E4型型比較檢驗(yàn)值，⑥P>0.05；⑦表示E2/E3型與E4/E4型比較檢驗(yàn)值，⑦P>0.05；⑧表示E2/E4型與E3/E4型比較檢驗(yàn)值，⑧P>0.05；⑨表示E2/E4型與E4/E4型比較檢驗(yàn)值，⑨P>0.05；⑩表示E3/E3型與E4/E4型比較檢驗(yàn)值，⑩P>0.05

3 討 論

AD為最常見(jiàn)的老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其起病隱匿，早期僅表現(xiàn)出情境記憶障礙，隨著病情進(jìn)展，逐漸表現(xiàn)出語(yǔ)言能力、精神行為、認(rèn)知功能等障礙，最終徹底喪失自我生活能力，多數(shù)患者于患病后的10～20年左右，并發(fā)其他疾病而死亡[5]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為其與多種基因及環(huán)境因素以及兩者間的相互作用有關(guān)。APOE的等位基因E4被證實(shí)與遲發(fā)型AD密切相關(guān)，是AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。

APOE是多個(gè)氨基酸構(gòu)成的糖蛋白，其參與脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)控。其主要合成至神經(jīng)、肝臟組織細(xì)胞，并在高密度蛋白(HDL-C)、乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、β-VLDL中表達(dá)[6]。APOE參與AD發(fā)生、進(jìn)展與其在修復(fù)神經(jīng)元損傷及調(diào)控髓鞘磷脂代謝有關(guān)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞損傷時(shí)，APOE表達(dá)量隨之增加，并在不同年齡分期中表達(dá)量有所不同[7]?，F(xiàn)代基因技術(shù)證實(shí)，APOE具有3種等位基因分別為APOE2、APOE3、APOE4，且存在6種不同基因亞型：純合子：E2/E2、E3/E3、E4/E4，雜合子：E2/E3、E2/E4、E3/E4，正常人體內(nèi)E3的表達(dá)頻率最高，E2、E4的表達(dá)頻率較低[8,9]。

本研究中結(jié)果表明，APOE的基因亞型表達(dá)中，4組患者的E3/E3、E3/E4亞型的表達(dá)量明顯高于其他亞型的表達(dá)，而在等位基因中，E3的表達(dá)頻率最高，與以往研究結(jié)果一致，此外發(fā)現(xiàn)，E4基因隨著年齡的增長(zhǎng)，而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。認(rèn)知功能方面，1組患者的MMSE評(píng)分高于2、3、4組，而ADAS-cog、ADL評(píng)分均低于2、3、4組，表明隨著AD發(fā)病年齡的升高，認(rèn)知功能障礙情況越嚴(yán)重，與張婷等[10]研究結(jié)果相同。Pearson相關(guān)分析結(jié)果中，APOE基因的表達(dá)與MMSE評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，而與ADAS-cog、ADL評(píng)分呈顯著正相關(guān)，提示APOE表達(dá)量越高，認(rèn)知功能障礙程度越深。

綜上所述，不同年齡分期老年AD患者APOE基因表達(dá)不同，且其APOE4基因的表達(dá)與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，故臨床中可通過(guò)調(diào)控APOE4基因的表達(dá)來(lái)延緩AD的發(fā)病年齡。