馮曉波， 李敏虹， 尚精娟， 周 穎

(上海市第七人民醫(yī)院胃腸疾病診療部， 上海 200136)

胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。雖然化療和手術(shù)方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，由于大多數(shù)患者被診斷為晚期疾病階段，其預(yù)后中位數(shù)總體生存時(shí)間≤12個(gè)月[1]。因此，研究者致力于開發(fā)新的藥物和研究其機(jī)制，以提高胃癌的診療水平。胃癌的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳因素與環(huán)境因素的相互作用。在這些機(jī)制中，GATA轉(zhuǎn)錄因子6(GATA6)可能是治療人類癌癥的新分子靶點(diǎn)。GATA6是GATA家族成員之一，表達(dá)于肺、胰腺、胃腸道等內(nèi)胚層組織和心臟等中胚層組織，通過與組織內(nèi)的(A/T)GATA(A/G)序列結(jié)合，調(diào)控組織中各種分化基因的表達(dá)[2]。除了分化，GATA6還與細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和各種細(xì)胞類型的腫瘤轉(zhuǎn)化有關(guān)[3]。研究表明，GATA6在包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥中過度表達(dá)；同時(shí)，GATA6的活性升高通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞遷移而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。葫蘆素是一類四環(huán)三萜類化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同分為葫蘆素A到T 17個(gè)亞型，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。其中葫蘆素B、D、E、I 具有顯著的抗瘤作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，葫蘆素D抗腫瘤的作用機(jī)制研究較少。本研究用不同濃度葫蘆素D干預(yù)SGC-7901胃癌細(xì)胞，觀察增殖和遷移情況，并檢測(cè)GATA6的水平，探討葫蘆素D治療胃癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器:SGC-7901胃癌細(xì)胞(批號(hào)：CK-0143，中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù))；葫蘆素D(批號(hào)：3877-86-9，純度≥98%，成都麥德生科技有限公司)；順鉑(純度99.99%，批號(hào)：P4394，美國(guó)sigma公司)；胎牛血清(批號(hào)：TBD21HY，美國(guó)Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)(批號(hào)：PM150210B、PM170319R，天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司)；四噻唑藍(lán)(Methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(批號(hào)：M4016-5，美國(guó)Amresco公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CA1020、CA1047，美國(guó)BD公司)；Trizol ReagentRNA提取試劑盒(批號(hào)：DP325，美國(guó)Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)：RR047A、TK08045，寶生物工程大連有限公司)；C170型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；3-18K型高速低溫離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；奧林巴斯CX43型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)；7500Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:用含胎牛血清(10%)的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)MTT法，以5×103/孔接種于96孔板中，200μL/孔，用不同濃度葫蘆素D(0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmoL/L)培養(yǎng)48h后加入MTT(50μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，加入DMSO(200μ/孔)，振蕩，用酶標(biāo)儀在450nm處檢定吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組OD值-處理組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。根據(jù)半數(shù)抑制率確定葫蘆素D的干預(yù)劑量。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、順鉑組、葫蘆素D低、中、高劑量組。對(duì)照組不進(jìn)行處理，順鉑組給予終濃度為10.0μmoL/L的順鉑，葫蘆素D低、中、高劑量組分別給予終濃度為2.0、4.0、8.0μmoL/L的葫蘆素D，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3細(xì)胞劃痕法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞遷移能力:以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)，200μL/孔，待細(xì)胞貼壁后，用100μL滅菌槍頭在單層細(xì)胞上呈“-”字劃痕，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基清洗3次，用不同劑量的葫蘆素D干預(yù)48h，用顯微鏡下拍照，3-5個(gè)視野/孔，用圖像分析儀測(cè)量劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)miRNA-143和GATA6 mRNA表達(dá):以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)，200μL/孔，待細(xì)胞貼壁后，用不同劑量的葫蘆素D干預(yù)48h，棄培養(yǎng)基，根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行總RNA提取，根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，再根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明，制備20ul反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，在CFX-96 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。GATA6、微小RNA-143(miRNA-143)和U6引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，GATA6上游引物為5'-CACACGCTGACAGTGCTGG -3'，下游引物為5'-TACAGGGCGATACAAAGCAGGAGAA-3'；miRNA-143上游引物為5'-ACACTCGAGCTGGGGCTTCTCCTGGCTCTCC-3'，下游引物為5'-TGGTGTGGTGGAGTCG-3'；U6引物序列：上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物為：5- ACGCTTCACGAATTTGCGT -3'；反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 30s、變性 95℃ 5s、60℃ 44s、40個(gè)循環(huán)，61 ℃時(shí)采集熒光，用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果分析，以U6作為內(nèi)參，采用 2-△△Ct法計(jì)算miRNA-143和GATA6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況:以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)，200μL/孔，待細(xì)胞貼壁后，用不同劑量的葫蘆素D干預(yù)48h，棄培養(yǎng)基，消化后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心棄上清，根據(jù)試劑盒說明書步驟，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:隨著葫蘆素D劑量增加，SGC-7901細(xì)胞抑制率增加，與0μmoL/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在葫蘆素劑量為8.0μmoL/L時(shí)，抑制率為53.07%，故選8.0μmoL/L作為最高干預(yù)劑量，并設(shè)2.0μmoL/L和4.0μmoL/L兩個(gè)劑量,見表1。

表1 不同濃度葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05

2.2葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響:與對(duì)照組比較，順鉑組SGC-7901細(xì)胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細(xì)胞遷移能力降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2、圖1。

表2 葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力和ROS水平的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

2.3葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞中miRNA-143和GATA6 mRNA表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，順鉑組SGC-7901細(xì)胞中miRNA-143 mRNA的相對(duì)表達(dá)量增加，GATA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細(xì)胞中miRNA-143 mRNA的相對(duì)表達(dá)量增加，GATA6 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞中miRNA-143和GATA6 mRNA表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

2.4葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響:與對(duì)照組比較，順鉑組SGC-7901細(xì)胞凋亡率和S期細(xì)胞比例增加，G0/G1期細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細(xì)胞凋亡率和S期細(xì)胞比例增加，G0/G1期細(xì)胞比例降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

圖1 葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

注A:對(duì)照組，B:順鉑組，C:葫蘆素D低劑量組，D:葫蘆素D中劑量組，E:葫蘆素D高劑量組

3 討 論

胃癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大最常見原因，盡管研究者對(duì)胃癌做了很多研究，但尚無有效的治療方法。大多數(shù)侵襲性胃癌患者對(duì)手術(shù)和放療無效，但作為姑息性治療對(duì)全身化療敏感。因此，開發(fā)胃癌潛在的替代化療藥物是非常令人鼓舞的。順鉑是常用一線化療藥，但其毒副作用較多。據(jù)報(bào)道，葫蘆素D可以抑制不同癌細(xì)胞的增殖，包括乳腺癌細(xì)胞、細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和肺鱗癌細(xì)胞[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，葫蘆素D對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性在轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用。許多報(bào)道的研究已經(jīng)證實(shí)了葫蘆素D對(duì)不同癌癥類型的遷移和侵襲的影響[6]。葫蘆素D的治療通過下調(diào)GATA6和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制肺癌遷移[7]。在另一項(xiàng)研究中，葫蘆素D通過體外抑制GATA6和Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A，RhoA)的表達(dá)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(Matrix metalloproteinase -2/9，MMP-2/9)的表達(dá)，抑制了人骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。然而，葫蘆素D對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能的影響尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，葫蘆素D在體外降低了胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移。因此，葫蘆素D有望成為抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的有效候選藥物。

GATA6參與細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和凋亡的調(diào)控[9]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GATA6增加了MKN28胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖；同時(shí)，通過對(duì)Wnt拮抗劑Dickkopf-1進(jìn)行負(fù)調(diào)控，激活Wnt信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)GATA6可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1和PANC-1的增殖[10]。已有研究表明，葫蘆素D對(duì)不同癌細(xì)胞的增殖抑制作用與G0/G1期、S期或G2/M期阻滯有關(guān)，而細(xì)胞阻滯在S期被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[11]。越來越多的文獻(xiàn)表明，miRNA-143在包括胃癌在內(nèi)的多種人類癌癥中發(fā)揮抑癌作用，參與包括腫瘤發(fā)生和發(fā)展在內(nèi)的許多生物學(xué)過程[12]。通過生物信息學(xué)分析顯示，miRNA-143與GATA6的3'UTR結(jié)合，表明GATA6是miRNA-143潛在是靶基因。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA-143調(diào)控了胃癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞中Ⅲ型膠原的表達(dá)，通過靶向GATA6抑制胃癌細(xì)胞自噬，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了槲皮素的化學(xué)敏感性[13]。本研究顯示，葫蘆素D可以上調(diào)miRNA-143的表達(dá)，從而抑制GATA6的表達(dá)，抑制了SGC-7901細(xì)胞的增殖，將SGC-7901細(xì)胞阻滯在S期，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，這更激發(fā)了我們對(duì)葫蘆素D潛在作用機(jī)制的探討。

綜上所述，葫蘆素D能抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖和遷移，引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有一定的抗癌活性，其機(jī)制可能與葫蘆素D通過下調(diào)GATA6表達(dá)有關(guān)，為葫蘆素D治療胃癌提供理論依據(jù)?？傊?，葫蘆素D可能是一種有希望的抗癌藥物，能夠?qū)刮赴┑倪M(jìn)展和轉(zhuǎn)移。