柴龍會(huì)，黃璞祎，暴旭

(東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

水體結(jié)冰是魚類越冬時(shí)常常面臨的挑戰(zhàn)，特別是在高寒地區(qū)的淺水區(qū)域，水體常會(huì)因?yàn)闅鉁氐募眲∠陆刀皟鐾浮?。水體完全結(jié)冰會(huì)引起魚類體液結(jié)冰、特別是會(huì)阻礙氣體交換，從而使魚類處于完全缺氧的環(huán)境。關(guān)于魚類適應(yīng)結(jié)冰水體的報(bào)道多集中于一些海水魚類，如南極魚類利用抗凍蛋白與冰的水合作用阻止冰晶進(jìn)入體內(nèi)并抑制體內(nèi)的冰晶生長[1]，為魚體提供1～2 ℃的熱保護(hù)[2]，因此，可以在低于冰點(diǎn)的海水環(huán)境(-1.91 ℃)中生存。關(guān)于淡水魚類耐受零下低溫的報(bào)道僅見于阿拉斯加黑魚Dalliapectoralis，其可以在-20 ℃的溫度下存活40 min，但是相關(guān)的耐受機(jī)制尚不清楚[3]。

葛氏鱸塘鱧Perccottusglenii主要分布于松花江流域，為了能夠在高寒地區(qū)的淺水區(qū)順利越冬，該魚可以在完全結(jié)冰缺氧的環(huán)境下生存數(shù)天，甚至在間歇“凍透”的水體中存活幾個(gè)月，因此，被當(dāng)?shù)貪O民稱為“還陽魚”。但是目前關(guān)于葛氏鱸塘鱧對(duì)水體完全結(jié)冰缺氧的耐受能力，以及對(duì)這種極端環(huán)境的生理生化響應(yīng)尚不清楚。為此，本研究中測定了葛氏鱸塘鱧在不同水體結(jié)冰溫度下的存活率，水體結(jié)冰前、水體完全結(jié)冰、魚體復(fù)蘇各階段的生理生化指標(biāo)，旨在為揭示淡水魚類對(duì)完全結(jié)冰缺氧環(huán)境的耐受機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2017年11月中旬(自然水溫4 ℃左右)采用地籠在松花江濕地采集葛氏鱸塘鱧，選擇體質(zhì)量相近(全長12.5 cm±1.8 cm、體質(zhì)量30.0 g± 2.7 g)的健康個(gè)體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，冰箱內(nèi)(4 ℃)暫養(yǎng)7 d，期間不投餌，每天全量換水1次，暫養(yǎng)期間溶氧不低于6 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 耐受試驗(yàn) 耐受的結(jié)冰溫度分別設(shè)置為-2、-3、-4、-5 ℃，持續(xù)時(shí)間分別設(shè)為24、72 h。試驗(yàn)開始后，將暫養(yǎng)的魚從4 ℃直接移入所設(shè)定溫度的冰箱中。降溫速率為1 ℃/h，至零度時(shí)水體存在一個(gè)結(jié)冰過程。由于設(shè)定溫度不同，各組結(jié)冰的時(shí)間為24～48 h。試驗(yàn)容器為5 L的透明食品保鮮盒，水的體積為4 L，每個(gè)容器內(nèi)放試驗(yàn)魚10尾。每個(gè)處理設(shè)置3組平行。溫度探頭放置在容器中間，并在靠近魚體的位置監(jiān)測溫度，在達(dá)到設(shè)定溫度和持續(xù)時(shí)間后，手工機(jī)械破冰，迅速將魚放入4 ℃水中，觀察其存活情況。為防止試驗(yàn)魚因低溫表現(xiàn)麻木引起的誤判，觀察時(shí)間持續(xù)4 h，以碰觸尾柄無反應(yīng)、鰓蓋無活動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)判斷死亡。

1.2.2 生理生化響應(yīng)試驗(yàn) 根據(jù)耐受試驗(yàn)結(jié)果，選擇存活率為100%的溫度-2 ℃和持續(xù)時(shí)間24 h的試驗(yàn)組進(jìn)行生理生化響應(yīng)試驗(yàn)。水體從表層開始結(jié)冰至完全結(jié)冰的過程約為48 h。根據(jù)水體的凍融過程共設(shè)置5組，分別為水體結(jié)冰前(T1組，水溫0 ℃，溶氧 6 mg/L)、水體完全結(jié)冰24 h(T2組，冰溫度-2 ℃，溶氧約為0 mg/L)和魚體復(fù)蘇1 h(T3組)、24 h(T4組)和72 h(T5組)(機(jī)械破冰后魚被直接移入4 ℃水中復(fù)蘇，溶氧6 mg/L)。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放5尾魚，試驗(yàn)共75尾魚。試驗(yàn)過程中監(jiān)測溫度和溶氧。

1.2.3 生化指標(biāo)測定 將試驗(yàn)魚置于冰盤上立即處死、解剖，分別取其肝臟、心臟、肌肉、鰓和腦組織，于-80 ℃保存待測。肝臟和肌肉的糖原含量，各組織中的葡萄糖、乳酸、總蛋白含量，乳酸脫氫酶(LDH)活性分別采用南京建成相應(yīng)試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)各階段不同組織中的生化指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛氏鱸塘鱧耐受水體結(jié)冰缺氧環(huán)境的能力

從表1可見：葛氏鱸塘鱧在-2 ℃持續(xù)24 h的存活率為100%，說明其可以短時(shí)間耐受較溫和的完全結(jié)冰缺氧環(huán)境；隨著溫度降低和結(jié)冰時(shí)間的延長，其存活率明顯下降，至-4 ℃時(shí)其24、72 h的存活率分別為30%和0，-5 ℃時(shí)其24 h的存活率為0。圖1為葛氏鱸塘鱧分別在水體完全結(jié)冰(圖1-A)、破冰(圖1-B)和復(fù)蘇階段(圖1-C)的狀態(tài)，從圖1-B可以看出，葛氏鱸塘鱧在冰中時(shí)的身體柔軟，碰觸尾柄有反應(yīng)，并未出現(xiàn)凍僵現(xiàn)象。

表1 不同溫度下葛氏鱸塘鱧的存活率(n=3)

Tab.1 Survival rates of Chinese sleeperPerccottusgleniiat different temperatures(n=3)

溫度/℃temperature持續(xù)時(shí)間/hduration存活率/%survivalrate-2247210080-324728060-42472300-5240

2.2 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚體復(fù)蘇期葛氏鱸塘鱧的肝/肌糖原含量

從圖2可見：水體結(jié)冰前(T1)葛氏鱸塘鱧的肝糖原水平為102.66 mg/g prot，在結(jié)冰期(T2)急劇降低至20.45 mg/g prot，隨后在魚體復(fù)蘇1 h(T3)和24 h(T4)的肝糖原含量仍有小幅下降，直到復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)肝糖原含量出現(xiàn)上升趨勢；葛氏鱸塘鱧在水體結(jié)冰期和復(fù)蘇期的肝糖原含量顯著低于水體結(jié)冰前的含量(P<0.05)，肌糖原含量的變化趨勢與肝糖原相似，但各組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚體復(fù)蘇期各組織的葡萄糖含量

從圖3可見：肌肉、鰓、腦和心臟中的葡萄糖含量水體結(jié)冰前(T1)均顯著低于水體結(jié)冰期(T2)和魚體復(fù)蘇期(T3～T5)(P<0.05)；肝臟中的葡萄糖含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，峰值為4.75 mmol/g prot，出現(xiàn)在水體結(jié)冰期(T2)，在魚體復(fù)蘇期逐漸降低，至魚體復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)葡萄糖含量降至1.87 mmol/g prot，且各階段葡萄糖含量的變化未達(dá)到顯著性水平(P>0.05)。從圖3還可以看出：鰓和腦組織中的葡萄糖含量在魚體復(fù)蘇1 h(T3)達(dá)到峰值后，隨復(fù)蘇時(shí)間的延長呈下降趨勢；肌肉和心臟中的葡萄糖含量在魚體復(fù)蘇72 h(T5)時(shí)達(dá)到最大值，分別為2.31、1.41 mmoL/g prot。

2.4 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚體復(fù)蘇期各組織的乳酸含量

從圖4可見：在水體結(jié)冰期(T2)和魚體復(fù)蘇期(T3～T5)，葛氏鱸塘鱧的腦和心臟組織中的乳酸含量顯著高于水體結(jié)冰前(P<0.05)，說明完全結(jié)冰缺氧環(huán)境下，組織中的無氧糖酵解加強(qiáng)，代謝終產(chǎn)物乳酸含量增加；各階段的肌肉和肝臟中乳酸含量無顯著性變化(P>0.05)。

2.5 水體結(jié)冰前、完全結(jié)冰和魚體復(fù)蘇期各組織的LDH活性

從圖5可見：試驗(yàn)各階段的葛氏鱸塘鱧各組織的LDH活性均無顯著性差異(P>0.05)，但仍可以看出，水體結(jié)冰期(T2)的鰓、腦和肝臟組織中的LDH活性較水體結(jié)冰前有不同程度的升高；復(fù)蘇期鰓、肌肉和心臟中的LDH活性最高值出現(xiàn)在魚體復(fù)蘇72 h(T5)，腦中的LDH活性最大值出現(xiàn)在魚體復(fù)蘇1 h(T3)，說明腦在復(fù)蘇1 h的無氧糖酵解活動(dòng)最高，而鰓、肌肉和心臟中的無氧糖酵解活動(dòng)則在復(fù)蘇72 h最活躍。

3 討論

3.1 魚類耐受環(huán)境結(jié)冰的能力

Evans等[2]研究發(fā)現(xiàn)，南極魚類及一些生活在極地水域的海水魚類可以在結(jié)冰的海水中生活，甚至可以在低于冰點(diǎn)的海水環(huán)境(-1.91 ℃)中生存。而關(guān)于淡水魚類耐受環(huán)境結(jié)冰的報(bào)道相對(duì)較少。目前已知能夠耐受水體完全結(jié)冰環(huán)境的淡水魚類是阿拉斯加黑魚Dalliapectoralis。阿拉斯加黑魚分布于阿拉斯加和白令島的淡水中，喜歡棲息在富含水生植物的湖泊、沼澤和池塘中，可以在完全結(jié)冰的環(huán)境下生存，甚至可以在-20 ℃存活40 min，但是60 min時(shí)會(huì)死亡[3]。本研究中葛氏鱸塘鱧在-2 ℃的冰中全部存活24 h，在-5 ℃的冰中24 h的存活率為0，破冰發(fā)現(xiàn)魚體柔軟并未出現(xiàn)僵硬的現(xiàn)象。這一結(jié)果說明葛氏鱸塘鱧具有與阿拉斯加黑魚相似的耐受環(huán)境完全結(jié)冰的能力，但也無法耐受身體完全被凍僵。

需要強(qiáng)調(diào)的是，阿拉斯加黑魚和葛氏鱸塘鱧都可以在環(huán)境完全結(jié)冰下生存一段時(shí)間，但是無法如某些兩棲類(如樹蛙Ranasylvatica)能夠耐受超過60%的體液結(jié)冰[4]。也就是說，它們并非是耐凍種類。但是它們進(jìn)化出的短期耐受環(huán)境完全結(jié)冰的能力，有助于其在極端天氣下引起的水體暫時(shí)“凍透”時(shí)存活。而且從棲息環(huán)境來看，葛氏鱸塘鱧與阿拉斯加黑魚有著共同的偏好，即喜歡棲息在富含水生植物的淡水淺水區(qū)。那么，這種水環(huán)境類型是否有助于淡水魚類進(jìn)化出耐受環(huán)境結(jié)冰的能力仍需要進(jìn)一步研究。

3.2 魚類的抗凍保護(hù)劑

在冰凍或零下的環(huán)境中，大部分動(dòng)物會(huì)采取積累抗凍保護(hù)劑(cryoprotectants)的策略來降低冰點(diǎn)、提高體液滲透壓，從而解決體內(nèi)結(jié)冰、細(xì)胞內(nèi)冰核再結(jié)晶等問題，常見的抗凍保護(hù)劑包括葡萄糖、蔗糖、甘油和抗凍(糖)蛋白等[5]。不同物種所選擇的抗凍保護(hù)劑種類和數(shù)量均不相同。例如，同樣生活在結(jié)冰溪流中的兩種水生搖蚊幼蟲Pseudodiamesabranickii和Diamesacinerella分別采用葡萄糖和蔗糖作為抗凍保護(hù)劑[6]。胡瓜魚Osmerusmordax則通過體內(nèi)積累甘油來適應(yīng)-1 ℃的低溫環(huán)境[7]。南極魚類則主要以抗凍(糖)蛋白作為抗凍物質(zhì)[2]。兩棲類和爬行類則多選擇葡萄糖作為抗凍保護(hù)劑，如阿拉斯加越冬的樹蛙R.sylvaticus[8]和歐洲普通蜥蜴Lacertavivipara[9]都采用葡萄糖作為抗凍物質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示，葛氏鱸塘鱧在水體結(jié)冰期和魚體復(fù)蘇期的肌肉、鰓、腦和心臟組織的葡萄糖含量均顯著高于水體結(jié)冰前；而在結(jié)冰期肝糖原含量顯著下降至結(jié)冰前的1/5左右，這說明葛氏鱸塘鱧很可能通過分解肝糖原在組織中積累葡萄糖作為細(xì)胞保護(hù)物，從而提高魚體耐受水體結(jié)冰的能力。而在魚體復(fù)蘇期，肝臟、鰓和腦組織的葡萄糖含量均出現(xiàn)下降趨勢，這可能是組織中的葡萄糖被重新轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，以肝糖原的形式儲(chǔ)存并為應(yīng)對(duì)下一次水體結(jié)冰做準(zhǔn)備。一些兩棲耐凍種類也會(huì)采取類似的耐受策略來應(yīng)對(duì)環(huán)境中的反復(fù)低溫脅迫[4]。

3.3 魚類對(duì)低溫缺氧環(huán)境的響應(yīng)

在完全結(jié)冰的水體中越冬需要適應(yīng)的另一個(gè)環(huán)境脅迫是缺氧。因?yàn)樗w完全結(jié)冰將魚體與外界空氣隔斷形成了一個(gè)極度缺氧的環(huán)境。在完全結(jié)冰的環(huán)境中，阿拉斯加黑魚的存活時(shí)間主要取決于其耐受缺氧的能力，其在水溫1 ℃條件下的封閉環(huán)境中，因?yàn)槿毖醵鵁o法生存超過24 h[3]。通常缺氧情況下，細(xì)胞的葡萄糖代謝從依賴氧的三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))轉(zhuǎn)換為不依賴氧的糖酵解代謝。例如，麥瑞加拉鯪魚Cirrhinusmrigala在缺氧72 h時(shí)糖酵解酶——己糖激酶、LDH和葡萄糖-6-磷酸酶的活性明顯增加[10]；印度鲇Clariasbatrachus在缺氧72 h時(shí)心臟和肌肉組織中的LDH活性顯著升高[11]，這說明多數(shù)魚類會(huì)通過提高糖酵解水平來適應(yīng)缺氧環(huán)境。

無氧糖酵解從每個(gè)葡萄糖分子中釋放2個(gè)ATP，而TCA循環(huán)能產(chǎn)生38個(gè)ATP，因此，缺氧細(xì)胞會(huì)通過增加葡萄糖的攝取來提升其生成ATP的能力。本研究中發(fā)現(xiàn)，水體結(jié)冰期葛氏鱸塘鱧在組織中大量積累葡萄糖也為無氧糖酵解提供了代謝底物。本試驗(yàn)過程中，葛氏鱸塘鱧所處的溶氧環(huán)境，從結(jié)冰前的6 mg/L逐漸下降至水體結(jié)冰24 h的0.22 mg/L，至完全結(jié)冰時(shí)溶氧接近0。在應(yīng)對(duì)水體結(jié)冰引起的缺氧環(huán)境中，葛氏鱸塘鱧的鰓、腦和心臟組織的糖酵解最終產(chǎn)物——乳酸的含量在水體完全結(jié)冰24 h時(shí)顯著升高，證實(shí)了其無氧糖酵解代謝增強(qiáng)。盡管葛氏鱸塘鱧各組織的LDH活性在結(jié)冰期和復(fù)蘇期有所升高，但均未達(dá)到顯著水平，這可能與其所處的溫度較低有關(guān)，而且葛氏鱸塘鱧在冰塊中停止一切運(yùn)動(dòng)(包括鰓蓋運(yùn)動(dòng))、所需能量降至最低水平，因此，LDH活性未出現(xiàn)顯著升高。