陳雷，姚鋒，唐爽，郭良勇，王珊，方蕾，秦玉雪，尹增強(qiáng)，侯林*

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081；2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023；3.遼寧省漁港與水產(chǎn)種苗中心，遼寧 大連 116000)

刺參Apostichopusjaponicus隸屬于棘皮動物門Echinodermata海參綱Holothuroidea楯手目Aspidochirota，是無脊椎動物中與脊索動物門Chordata種類最為接近的后口類動物類群，其所處分類地位十分特殊[1]。刺參廣泛分布于西北太平洋沿岸，是中國黃渤海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)生物[2]。當(dāng)受到敵害攻擊或不良自然環(huán)境影響時，如水溫驟變、水質(zhì)惡化、海水中病原菌大量滋生等，刺參會表現(xiàn)出特殊的防御機(jī)制——“吐臟”，即將大部分消化道和與之相連的器官(呼吸樹、性腺、血管系統(tǒng)等)通過泄殖腔破裂的方式排出體外，而刺參吐出消化道后，在食道與泄殖腔的殘肢部位留下2個斷面[3]，經(jīng)過一定時間的再生便可形成一套完整的內(nèi)臟器官。一般認(rèn)為，在海參內(nèi)臟再生過程中既涉及變形再生，又涉及新建(發(fā)育)再生[4]。迄今為止，關(guān)于海參再生的研究主要集中在組織形態(tài)和分子水平。

多功能表皮生長因子(multiple epidermal growth factor，MEGF)是通過檢測蛋白N-末端區(qū)域的EGF樣結(jié)構(gòu)域時而被發(fā)現(xiàn)的[5]，其具有與表皮生長因子(EGF)相近的結(jié)構(gòu)和功能特征[6]，即都具有EGF樣結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是進(jìn)化上非常保守的模塊化蛋白亞單位，一般由30～40個氨基酸殘基構(gòu)成[7]。已有研究證明，MEGF在胚胎發(fā)育、機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中具有重要作用，表現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附、遷移等[8-9]。早期研究中已鑒定出9個megf基因家族成員(megf1～megf9)，在后期高通量篩選中又發(fā)現(xiàn)了3個(megf10、megf11、megf12)[10-11]。MEGF蛋白家族具有相對分子量大(>100 000)的特點，家族中MEGF1～MEGF3和MEGF7～MEGF12是膜錨定蛋白，MEGF4～MEGF6為分泌蛋白[12]。截至目前，多種生物的megf基因家族的mRNA序列已經(jīng)被得到，但關(guān)于刺參中megf的研究報道非常少?；诒緦嶒炇肄D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，megf6在刺參腸再生的第5、10天時表達(dá)上調(diào)，結(jié)合megf6具有調(diào)控組織細(xì)胞生長和遷移功能的已有研究結(jié)果[13]，推斷megf6可能與刺參再生有一定關(guān)系。

MEGF6，又名EGFL3，是一種具有30余個egf樣結(jié)構(gòu)域的大分子量蛋白，megf6基因定位于人類1號染色體(1p36.32)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，megf6基因敲除的小鼠是可正常發(fā)育的，但表達(dá)megf6的細(xì)胞可以參與皮膚表皮、大腦和肋骨的組分形成[14]；megf6在成骨樣細(xì)胞中表達(dá)，并能作為血管生成因子促進(jìn)血管生成[8]；也有研究證明，MEGF6與神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂發(fā)生有關(guān)[15]。本研究中，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)和實時定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative PCR，qPCR)首次獲得刺參megf6基因(簡稱為Aj-megf6)的cDNA全長序列，分析了基因的序列信息及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并探究了megf6在刺參腸再生過程中的表達(dá)變化，以期確定其生物學(xué)功能，為豐富megf6基因的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參購于大連市新長興水產(chǎn)品市場，體質(zhì)量為(92.0±4.0)g，飼養(yǎng)于大連海洋大學(xué)實驗室玻璃鋼水槽(85 cm×45 cm×45 cm)中，水溫為(16.0±0.5)℃，鹽度為30.5±1.0，pH為8.10±0.05，24 h不間斷充氣，每天換水一次，換水量為總水體的1/3。試驗前暫養(yǎng)10 d，暫養(yǎng)期間和吐臟再生10 d后，每天投喂有機(jī)底泥和藻粉混合物(體積比1∶1)一次，投喂量為刺參體質(zhì)量的5%。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 暫養(yǎng)結(jié)束后取5頭刺參解剖，取其腸組織，置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，用于基因克隆所需的總RNA提取。另取75頭刺參通過體腔注射2 mL、0.35 mol/L KCl溶液，刺激排出內(nèi)臟后用于再生試驗。刺參吐臟后24 h為再生1 d，在再生3、6、9、12、15、18、21 d時，分別取5頭刺參解剖，觀察腸的形態(tài)變化后取出再生腸，置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，用于qPCR所需的總RNA提取。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的獲得 采用Trizol 試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行各時期腸樣品的總RNA提取，并按照柳林等[16]的方法對總RNA的完整性進(jìn)行檢測，并將完整性好的總RNA樣品在oligo(dT)引物和MLV反轉(zhuǎn)酶(大連TaKaRa公司)參與下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣品，并于冰箱(-20 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Aj-megf6基因EST序列的獲得 從NCBI(National Center for Biotechnology Information)中下載刺參megf基因家族的EST序列，并利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計上下游引物，交由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。本試驗所用引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：ddH2O 12.8 μL，cDNA樣品1 μL，10×Easy Taq Buffer(+Mg2+)2 μL，dNTP Mixture 2 μL，上、下游引物各1 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性1 min；94 ℃下變性30 s，49 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共32個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量；利用DNA回收試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)回收、純化PCR產(chǎn)物中的目標(biāo)片段，并與pEASY-T1載體(北京索萊寶科技有限公司)連接后，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，先后在液體、固體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，挑取單個菌落，使用M13上、下游引物(表1)進(jìn)行菌液PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將陽性克隆樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果于NCBI在線工具中進(jìn)行比對，得到Aj-megf6基因的EST序列。

1.2.4Aj-megf6基因cDNA全長序列的獲得 以獲得的megf6基因EST序列為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計5′、3′ RACE引物(表1)，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按照SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒(Clontech實驗室，美國)說明書進(jìn)行5′、3′ RACE模板的制備。RACE反應(yīng)體系(50 μL)：5′或3′ RACE模板2.5 μL，UPM(10×)5.0 μL，5′或3′引物1.0 μL，ddH2O 34.5 μL，Advantage 2 PCR Buffer(10×)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Advantage 2 Polymerase Mi(50×)1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃下變性5 s，68 ℃下退火復(fù)性10 s，72 ℃下延伸3 min，共進(jìn)行28個循環(huán)。PCR產(chǎn)物的檢測、回收、純化及測序方法同EST序列。利用DNAMAN軟件對EST、5′端、3′端序列進(jìn)行拼接，得到Aj-megf6基因的cDNA全長序列，并利用NCBI中的BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對分析。

表1Aj-megf6基因克隆和qPCR用引物序列

Tab.1 Nucleotide sequences of primers used forAj-megf6 genes cloning and for qPCR

引物primer序列sequence(5′-3′)退火溫度Tm/℃用途purposeAj-megf6F:CAGATTGTAACTGCTATGATGGCR:GCATGTATCTCCAGTAAATCCTGCTCTCTGTACAATCTTGGCCCCTCACCATAGTAACCTGCCAAACAAGTAGGGCTACATTGCTGACCGTTACAGATAGTTCCGGTCCAGCCAGCAGTTCATAGCCATGTCTACACGCCATTACGCAACGCACAAGGATTGAGGATGCCAAGAAGGAAGATTTTAAATGGAGGCCGTTGTGACAGAF:CGGTCCTTACTGTGCGGAGAR:CGTCCTCCCAGCTGGACATC49EST555′RACE-1555′RACE-2555′RACE-3555′RACE-4555′RACE-5555′RACE-6553′RACE-1553′RACE-260qPCRAj-gapdhF:GACCGAGCGCAAAGAAGTGGR:ACGGAAGGCCATGCCAGTAA60qPCRM13F:TGTAAAACGACGGCCAGTR:TCACACAGGAAACAGCTATGAC49菌液PCR

1.2.5Aj-megf6基因的生物學(xué)信息分析 生物信息學(xué)分析按照孫冉冉等[17]對黃條鰤pten基因生物信息學(xué)分析時采用的方法進(jìn)行。利用ClustalX和 DNAMAN 9.0軟件對Aj-MEGF6和選取的其他18個物種MEGF6的氨基酸序列、MEGF家族中39條氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，并利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建基于鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(重復(fù)計算1000次)。

1.2.6 腸再生過程中Aj-megf6的表達(dá)分析 提取刺參再生過程中各時期(再生3、6、9、12、15、18、21 d)腸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA樣品，并稀釋濃度至100 ng/μL。按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書進(jìn)行qPCR，檢測Aj-megf6基因的表達(dá)水平。以正常未吐臟刺參的腸為對照組，選取刺參的gapdh基因為內(nèi)參基因(表1)，Aj-megf6基因的擴(kuò)增片段長度為171 bp，gapdh基因的擴(kuò)增片段長度為134 bp。反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，cDNA樣品2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。使用Applied Biosystems StepOnePlus Real-time PCR System、兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序，第1步，95 ℃下預(yù)變性30 s；第2步，95 ℃下變性5 s，60 ℃下退火30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用 LSD法進(jìn)行多重比較，顯著性、極顯著性水平分別設(shè)為0.05、0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 Aj-megf6全長cDNA序列和生物信息學(xué)分析

刺參megf6基因cDNA全長序列為5665 bp，由389 bp的5′端非編碼區(qū)(5′ Untranslated region, UTR)、4815 bp的開放閱讀框序列和461 bp的3′端非編碼區(qū)組成。開放閱讀框序列共編碼1604個氨基酸，具有37個EGF樣結(jié)構(gòu)域(圖1)。利用ProtParam tool of ExPASy分析預(yù)測Aj-MEGF6蛋白的相對分子質(zhì)量為172 500、等電點為4.74。對該蛋白的親、疏水性預(yù)測分析得到，其平均值為-0.486(最大值3.389，最小值-2.700)，表明該蛋白可能是親水性蛋白。用NetPhos 3.1 Server分析預(yù)測該蛋白共有53個磷酸化位點，其中有23個Ser位點、12個Thr位點、18個Tyr位點。Aj-MEGF6蛋白具有信號肽，為分泌蛋白，但不具有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非跨膜蛋白。Aj-MEGF6蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，有173個α螺旋、286個延伸鏈、197個β轉(zhuǎn)角和948個無規(guī)則卷曲。

2.2 Aj-MEGF6序列同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過多序列比對，刺參與其他18個物種的MEGF6氨基酸序列的一致性為38.59%～49.07%，其中與紫球海膽S.purpuratus的一致性最高，為49.07%，與長棘海星A.planci次之(48.71%)。利用ClustalX和MEGA 4.1軟件，以19種生物的MEGF6氨基酸序列構(gòu)建了NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果顯示，19種生物聚為兩支，一支為脊椎動物，另一支為無脊椎動物。在無脊椎動物中，刺參與長棘海星、紫球海膽聚為一個分支，這符合刺參為棘皮動物的分類地位。利用Aj-MEGF6與MEGF家族中39條氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，同類MEGF的多個物種聚為一支，表明MEGF家族成員間具有一定的分化(圖3)。

2.3 再生過程中腸的形態(tài)變化

刺參吐臟后，消化道前、后端分別在食道與胃部連接處、腸與泄殖腔連接處斷裂，在體內(nèi)留下食道及泄殖腔的殘體。再生3～21 d時腸管逐漸增長；再生15 d時腸管前后貫通呈直線型，并有食物出現(xiàn)；再生18 d時腸形成繞環(huán)現(xiàn)象，外部形態(tài)已近似正常刺參狀態(tài)(圖4)。

2.4 腸再生過程中Aj-megf6基因的表達(dá)分析

在刺參腸再生過程中，megf6基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，其中在再生6 d時達(dá)到峰值，為對照組的126.47倍；自再生6 d后，表達(dá)量呈下降趨勢；再生過程中，除了再生18、21 d時megf6基因表達(dá)水平與對照組無顯著差異外，在其他時期均有顯著或極顯著性差異(P<0.05或P<0.01)(圖5)。

3 討論

3.1 刺參megf6基因的序列特征

本研究中，利用RACE技術(shù)首次克隆得到了成體刺參megf6基因的cDNA全長序列。生物信息學(xué)分析顯示，該序列中開放閱讀框為4815 bp，共編碼1604個氨基酸。Aj-MEGF6包含37個EGF樣結(jié)構(gòu)域，這與Letunic and Bork利用SMART蛋白質(zhì)注釋工具對MEGF6結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果相符合[12]。通過與18種其他生物的MEGF6氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，19種生物的MEGF6氨基酸數(shù)量為1379～1717，刺參MEGF6的氨基酸序列與同源性最高的紫球海膽MEGF6相比，多出146個氨基酸，與長棘海星相比，多出225個氨基酸，與脊椎動物的MEGF6相比，氨基酸數(shù)量差值為-113～140，未表現(xiàn)出明顯規(guī)律。通過多序列比對，刺參與其他18種生物的MEGF6氨基酸序列的一致性為38.59%～49.07%，其中與紫球海膽的一致性最高，為49.07%，與長棘海星次之(48.71%)；構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，刺參與紫球海膽、長棘海星聚為一個分支。這些結(jié)果表明，MEGF6在生物進(jìn)化中具有一定的保守性，并且符合刺參與紫球海膽、長棘海星為棘皮動物的分類地位。MEGF家族成員間比對分析表明，MEGF1～MEGF12間具有比較明顯的分化現(xiàn)象。

3.2 megf6在刺參腸再生過程中的表達(dá)模式

再生是一個與發(fā)育類似的復(fù)雜過程，也是一個多基因調(diào)控的生理現(xiàn)象。有關(guān)海參吐臟再生的機(jī)制目前認(rèn)為有兩種，即變形再生和新建(發(fā)育)再生。變形再生指海參排臟后的殘留組織自身重建形成新的組織器官，而相應(yīng)的細(xì)胞是通過分化、遷移完成的，不涉及細(xì)胞增殖和分裂活動。新建(發(fā)育)再生指再生過程中有細(xì)胞的分裂、增殖發(fā)生，新生細(xì)胞取代了原有的部位而形成一個新的胚基[18]。這兩種再生機(jī)制會因海參種類的不同而表現(xiàn)出差異性，其中刺參的腸再生涉及的機(jī)制應(yīng)是兩種相融合的情況[4]，而早期以變形再生(遷移)為主，后期以新建再生(增殖)為主[19]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，megf6基因在刺參腸再生過程中顯著上調(diào)，其中再生6 d時達(dá)到峰值，再生18 d時，其表達(dá)水平下降至正常水平。根據(jù)王霞等[20]對刺參消化道再生的研究結(jié)果，6 d時正是刺參吐臟后，食道與胃部斷裂處、腸系膜斷裂處的傷口愈合及原基形成階段，有大量細(xì)胞分化和增殖現(xiàn)象發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，在刺參腸再生第3天時，漿膜層、結(jié)締組織層中增殖細(xì)胞比例不到3%，而再生第7天時，細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯，約占細(xì)胞總數(shù)的29.5%，再生第14～21天時，細(xì)胞分裂活動減弱，腸腔上皮細(xì)胞分裂率下降至14.2%[19]。而在另一種海參Holothuriaglaberrima的再生研究中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律，再生6 d時增殖細(xì)胞所占比例最高，為12%，再生12 d時下降至6%，并在再生后期逐漸下降[21]。本研究中，通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，再生過程中的腸管隨時間而逐漸延長，再生15 d時再生腸管前后貫通，刺參具有攝食和消化行為；再生18～21 d時腸管進(jìn)一步生長及復(fù)雜化。Aj-megf6基因表達(dá)量的變化趨勢與腸細(xì)胞增殖活動、腸管形態(tài)變化相吻合，推斷Aj-megf6基因與刺參腸再生活動密切相關(guān)。

3.3 megf6在刺參腸再生過程中的作用機(jī)制

腸再生過程中，腸系膜的形態(tài)變化往往被認(rèn)為是消化道再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[20]。腸再生初期，腸系膜的游離端出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，增厚過程涉及體腔上皮細(xì)胞的去分化、細(xì)胞增殖、再分化[20]。形成腸管的細(xì)胞主要是腸腔上皮細(xì)胞及腸系膜增厚區(qū)的間充質(zhì)細(xì)胞[22]。已有研究表明，megf6具有調(diào)控組織細(xì)胞生長、遷移、黏附、變性的功能[13，15]，其調(diào)控過程中涉及的CDH1(E-鈣黏蛋白1，cadherin 1)可介導(dǎo)基底膜細(xì)胞間的連接，其異常表達(dá)會降低細(xì)胞間的黏附作用，使細(xì)胞易與周圍組織分離[23]。CDH1缺失會促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖及轉(zhuǎn)移[24]，而誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)是其重要機(jī)制之一[25]。已有研究表明，SNAI家族(Snail and Slug)是CDH1的抑制因子之一[26-27]。megf6基因敲除可以顯著抑制SNAI2的mRNA表達(dá)，而且癌癥基因組圖譜(TCGA)顯示，megf6 mRNA的表達(dá)與SNAI2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系[28]。megf6可以通過轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)/SMAD信號途徑介導(dǎo)，下調(diào)Slug而抑制EMT；當(dāng)megf6誘導(dǎo)Slug表達(dá)可以促進(jìn)EMT，引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而且間充質(zhì)細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的，是正常發(fā)育、傷口愈合的基礎(chǔ)[28]。刺參再生腸腔上皮層是來自腸系膜增厚處的間充質(zhì)細(xì)胞[19]，因此，推測在刺參腸再生過程中，megf6基因高表達(dá)時，上調(diào)CDH1的相關(guān)抑制因子表達(dá)，促進(jìn)了上皮細(xì)胞向具有間質(zhì)表型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為實現(xiàn)腸組織的再生重建提供了細(xì)胞來源。隨著再生腸管的生長延伸，再生18 d時，刺參再生腸管已基本恢復(fù)至正常狀態(tài)，megf6的表達(dá)下調(diào)時，腸管中細(xì)胞的增殖、分化活動減弱。