黃申 馬寧 王瓊波 霍夢(mèng)杰 周利峰 馮穎杰 楊峰 毛多斌

關(guān)鍵詞：再造煙葉濃縮液;增香菌;篩選;鑒定;產(chǎn)蛋白霉菌

摘要：采用稀釋涂布平板法，從再造煙葉濃縮液中篩選分離得到一株增香菌株HS-1，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，進(jìn)而對(duì)最優(yōu)培養(yǎng)條件下發(fā)酵再造煙葉濃縮液中性香味成分進(jìn)行分析.結(jié)果表明：菌株HS-1為產(chǎn)蛋白霉菌屬（Planococcus sp.），其最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度30 ℃，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間36 h;該培養(yǎng)條件下，經(jīng)菌株HS-1發(fā)酵的再造煙葉濃縮液中，中性香味成分總含量由發(fā)酵前的56.845%提高到72.527%，且中性香味成分的種類(lèi)和含量均有所增加，其中5-甲基糠醛和β-紫羅蘭酮為發(fā)酵后新增成分，苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、茄酮、β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮等成分均有不同程度增加.

Abstract：A flavor-enhancing strain HS-1， was screened and isolated from the reconstituted tobacco concentrate by dilute coating plate method.The strain was identified and the culture conditions for fermentation of the strain were optimized. The neutral aroma components of the reconstituted tobacco concentrate fermented under the optimal culture conditions were analyzed. The results showed that HS-1 was Planococcus sp.，the optimal culture conditions for fermentation were fermentation temperature of 30 ℃， inoculation amount of 5%， and fermentation time of 36 h. Under this culture condition， the total content of neutral aroma components in the reconstituted tobacco concentrate fermented by HS-1 was increased from 56.845% before fermentation to 72.527%， and the types and contents of neutral aroma components had increased. 5-methylfurfural and β-ionone were new ingredients after fermentation， the components such as benzyl alcohol， phenylacetaldehyde， 2-acetylpyrrole， phenethyl alcohol， solanone，β-damascenone， dihydroactinidiolide and megastigmatrienone had increased in varying degrees after fermentation.

0 引言

再造煙葉是以卷煙生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄煙草物質(zhì)（煙末、煙梗、碎煙片等）為原料，采用物理或化學(xué)方法重新組合加工制成的片狀或絲狀再生產(chǎn)品，可用作卷煙填充料[1].目前，再造煙葉通常按8%～10%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入到卷煙配方中，起到降焦減害的作用[2-3].雖然，再造煙葉已經(jīng)成為卷煙產(chǎn)品必不可少的重要原料，但再造煙葉中性香味成分的含量與天然煙葉相比有較大的差距，這是再造煙葉在感官品質(zhì)上與天然煙葉存在差距的重要原因[4-6].引起中性香味成分含量差異的主要原因有兩點(diǎn)：一是再造煙葉原料基礎(chǔ)較差;二是經(jīng)過(guò)萃取濃縮、高溫烘干等工藝過(guò)程后，煙草原料中性香味成分大量流失.為提高再造煙葉的香氣量，目前普遍采用的增香技術(shù)是添加香精香料，該方法屬于外源性增香，能夠通過(guò)掩蓋雜氣和協(xié)調(diào)香氣的方式對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行修飾和完善，從而進(jìn)一步彰顯產(chǎn)品風(fēng)格，但是該方法不能改變產(chǎn)品根源性的感官品質(zhì)不佳的缺陷.因此，為提升再造煙葉的感官品質(zhì)，有必要開(kāi)展內(nèi)源性增香技術(shù)的研究[7-9].

產(chǎn)香微生物可以利用其體內(nèi)分泌的各類(lèi)酶，將中性香味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為中性香味物質(zhì)，而煙草提取液和濃縮液可以為產(chǎn)香微生物生長(zhǎng)提供充足的碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)成分，該方法即為內(nèi)源性增香技術(shù).因此，篩選能適應(yīng)再造煙葉濃縮液環(huán)境并能增加再造煙葉濃縮液香氣量、提升再造煙葉濃縮液香氣質(zhì)的微生物，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值[10-12].目前，采用微生物發(fā)酵來(lái)改善再造煙葉香氣品質(zhì)的研究相對(duì)較少.鑒于此，本文擬從再造煙葉濃縮液中篩選出能夠產(chǎn)香的微生物，并對(duì)其最優(yōu)培養(yǎng)條件和增香效果進(jìn)行研究，以期為內(nèi)源性增香技術(shù)的發(fā)展提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：再造煙葉濃縮液KM-13（QTX），QTX-18，ZY-01，ZY-02，X-2，TS-0002，TS-0003，TS-0005，均由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司產(chǎn).

試劑：胰蛋白胨（生物級(jí)）、酵母提取物（生物級(jí)），英國(guó)Oxford公司產(chǎn);NaCl，無(wú)水Na2SO4，NaOH，HCl，無(wú)水乙醇，CH2Cl2，以上試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn).

儀器：LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn);DHP-9162型恒溫培養(yǎng)箱，TH2-C型恒溫?fù)u床，太倉(cāng)市科教器材廠產(chǎn); 6890a/5975c型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn);R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn);ZDHW型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn);J6-MI型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司產(chǎn);SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn);DLSB-1020型低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州國(guó)瑞儀器有限公司產(chǎn);BSA323S型電子天平，賽多利科學(xué)儀器有限公司產(chǎn);MS205DU型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn).

1.2 培養(yǎng)基

察式液體培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO3 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖 30 g/L，121 ℃，20 min高壓滅菌，4 ℃保存.

察式固體培養(yǎng)基：在每L察式液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，即得.

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 20 g/L，酵母粉 5 g/L，121 ℃，20 min高壓滅菌，4 ℃ 保存.

LB固體培養(yǎng)基：在每L LB液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，即得.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌源的富集

取0.5 mL不同來(lái)源的再造煙葉濃縮液樣品，接種到裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)12 h，得到菌源A.取0.5 mL不同來(lái)源的再造煙葉濃縮液樣品，接種到裝有30 mL察氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，得到菌源B[13].

1.3.2 菌種的篩選

分別移取0.5 mL菌源A和0.5 mL菌源B，接種到30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的再造煙葉濃縮液（滅菌）中，于30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)3 d.然后分別移取1 mL 樣品，按照10-2，10-4，10-6濃度梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)俜謩e移取100 μL稀釋菌液到LB固體培養(yǎng)基和察氏固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，每個(gè)濃度梯度平行涂布3個(gè)平板.待操作完成后，將平板倒置于培養(yǎng)箱中，于 30 ℃ 溫度下培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株是否生長(zhǎng).從長(zhǎng)有菌株的平板中挑選出形態(tài)較好的單菌落，于平板中反復(fù)劃線進(jìn)行分離純化，只有目標(biāo)菌生長(zhǎng)即可確認(rèn)為純培養(yǎng).單菌落活化后進(jìn)化液體培養(yǎng)，將菌種置于甘油管內(nèi)，放于-80 ℃冰箱保存.

1.3.3 菌種的馴化

將篩選后保存的菌種活化后，在LB液體培養(yǎng)基或察氏液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的接種量接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的再造煙葉濃縮液（滅菌）中，于30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng) 3 d;按上述條件轉(zhuǎn)接一次后，再按1%的接種量接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的再造煙葉濃縮液（滅菌）中，于30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)3 d;按上述條件再轉(zhuǎn)接一次后，馴化完成.接著，利用稀釋涂布平板法獲得單菌落，利用LB液體培養(yǎng)基或察氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，將菌種置于甘油管中，放于-80 ℃冰箱中保存.

1.3.4 增香菌的確認(rèn)

將馴化后保存的菌種活化后，按1%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，將搖瓶置于30 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h，獲得種子液，再按5%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有30 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的再造煙葉濃縮液的三角瓶中，將其置于30 ℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h.同時(shí)，將等體積的無(wú)菌水作為對(duì)照添加到裝有30 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的再造煙葉濃縮液中，在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h.發(fā)酵完成后進(jìn)行中性香味成分分析，使香味成分含量增加的菌種即為增香菌.

1.3.5 菌株鑒定

1.3.5.1 形態(tài)觀察和革蘭氏染色

在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)，參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行菌株的革蘭氏染色.

1.3.5.2 16S rDNA序列擴(kuò)增、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株基因組DNA.PCR反應(yīng)引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，上游引物為5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成.PCR反應(yīng)體系為：Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，10×Buffer（10 μmol/L）2.5 μL，DNA模板（50 ng/μL）0.5 μL，dNTP（10 μmol/L）1 μL，ddH2O（滅菌蒸餾水）19.8 μL.測(cè)序由上海生物工程有限公司完成.利用BLAST軟件將得到的基因序列在NCBI GeneBank中進(jìn)行同源性檢測(cè)，

利用 MEGA 5.1軟件構(gòu)建16S rDNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.

1.3.6 再造煙葉濃縮液中性香味成分的提取和分析

1.3.6.1 中性香味成分的提取

移取再造煙葉濃縮液25 mL放入1000 mL的圓底蒸餾燒瓶中，加入500 mL蒸餾水和100 g無(wú)水Na2SO4后，進(jìn)行加熱;向濃縮瓶中加入80 mL的CH2Cl2，在60 ℃恒溫水浴中加熱2.5 h.萃取后的溶液分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀HCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的稀NaOH洗滌3次，得到中性香味成分提取液，加入適量的無(wú)水Na2SO4，干燥過(guò)夜.于60 ℃恒溫水浴條件下濃縮至1 mL，進(jìn)行GC-MS分析[14-15].

1.3.6.2 中性香味成分的分析

GC-MS分析條件如下.

色譜條件：Agilent HP-5MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度280 ℃;載氣為高純He（99.999%），流速為1.0 mL/min;升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持 4 min，然后以2 ℃/min的速率升溫至240 ℃，結(jié)束;不分流;進(jìn)樣量1.0 μL;采用全掃模式.

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃;電離方式為電子轟擊（EI），電子能量70 eV;溶劑延遲時(shí)間8 min;全掃質(zhì)量范圍（m/z）為35～550 u.

1.3.7 再造煙葉濃縮液增香菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.7.1 單因素試驗(yàn)

取多個(gè)100 mL的再造煙葉濃縮液TS-0005，分別儲(chǔ)存于250 mL的三角瓶中，加入一定量的增香菌，利用同時(shí)蒸餾萃取法，分別考察發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響.考察發(fā)酵溫度的影響時(shí)，將發(fā)酵溫度設(shè)為26 ℃，28 ℃，30 ℃，32 ℃，34 ℃共5個(gè)梯度，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間 24 h;考察接種量的影響時(shí)，將接種量設(shè)為1%，3%，5%，7%，9%共 5個(gè)梯度，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h;考察發(fā)酵時(shí)間的影響時(shí)，將發(fā)酵時(shí)間設(shè)為12 h，24 h，36 h，48 h，60 h共5個(gè)梯度，發(fā)酵溫度 30 ℃，接種量7%.

1.3.7.2 正交試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取合理的水平，根據(jù)參考文獻(xiàn)[17-18]中的方法進(jìn)行正交試驗(yàn).

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

將未經(jīng)發(fā)酵處理（對(duì)照組）和經(jīng)發(fā)酵處理（實(shí)驗(yàn)組）的再造煙葉濃縮液按照39%的涂布率涂布于再造煙葉片基上，于90 ℃條件下烘10 min，回潮至含12.5%水分，切絲卷煙，作為樣品，由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司組織11名評(píng)吸專(zhuān)家進(jìn)行評(píng)吸.

39%涂布率所需再造煙葉濃縮液的計(jì)算方法為先稱(chēng)取再造煙葉片基，由再造煙葉片基的質(zhì)量推算出再造煙葉濃縮液的質(zhì)量，公式如下.

再造煙葉濃縮液質(zhì)量=再造煙葉片基質(zhì)量×0.88×1.64+0.5

回潮加水質(zhì)量=再造煙葉濃縮液質(zhì)量×1.6

2 結(jié)果與討論

2.1 增香菌的篩選與確認(rèn)結(jié)果

從初烤后不同牌號(hào)的再造煙葉濃縮液中篩選到1株能增加再造煙葉濃縮液香氣的增香菌菌株HS-1.經(jīng)GC-MS檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，該菌株使苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇、β-二氫大馬酮、β-大馬酮的含量相比發(fā)酵前均有不同程度的增加.

2.2 增香菌株HS-1的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株HS-1的形態(tài)學(xué)特征

菌株HS-1的菌落形態(tài)如圖1所示.由圖1可知，菌株HS-1的菌落表面有光澤，邊緣整齊.經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡（×100）下觀察菌株HS-1的微觀形態(tài)，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，菌體分布均勻，呈絲狀，菌體大小為2 μm左右.

2.2.2 菌株HS-1的進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)菌株HS-1基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1425 bp的核酸序列.在NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性分析，發(fā)現(xiàn)菌株HS-1擴(kuò)增出的1425 bp核酸序列與Planococcus sp.的同源性為100%.

菌株HS-1與其相似菌株的16S rDNA區(qū)域序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示.由圖3可知，菌株HS-1與產(chǎn)蛋白霉菌（Planomicrobium sp.）聚為一類(lèi).結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，初步鑒定菌株HS-1為產(chǎn)蛋白霉菌屬.

2.3 增香菌株HS-1發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響如圖4所示.由圖4可知，隨發(fā)酵溫度的升高，中性香味成分含量呈先增加后減少的趨勢(shì).這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵溫度的上升，菌落生長(zhǎng)代謝和繁殖的酶失去活性，以至于發(fā)酵周期縮短.因此，確定正交試驗(yàn)中發(fā)酵溫度水平范圍為28 ℃，30 ℃，32 ℃，34 ℃.

2.3.1.2 菌株HS-1接種量對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響

菌株HS-1接種量對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響如圖5所示.由圖5可知，隨增香菌接種量的升高，中性香味成分含量呈先增加后減少的趨勢(shì).這可能是因?yàn)樵鱿憔臃N量超過(guò)一定值后達(dá)到飽和狀態(tài)，中性香味成分含量不會(huì)因增香菌接種量增加再次明顯增加.因此，確定正交試驗(yàn)中增香菌接種量水平范圍為3%，5%，7%，9%.

2.3.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量的影響如圖6所示.由圖6

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為設(shè)計(jì)因素，以再造煙葉濃縮液的中性香味成分含量為指標(biāo)進(jìn)行L16（43）正交試驗(yàn).正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，各因素方差分析見(jiàn)表3.

由表2可知，各因素對(duì)發(fā)酵后再造煙葉濃縮液中性香味成分含量影響大小的順序?yàn)锽>C>A，即接種量對(duì)中性香味成分含量的影響最大，發(fā)酵時(shí)間次之，發(fā)酵溫度的影響最小.

再造煙葉濃縮液發(fā)酵的最佳條件是A2B2C3，即發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為36 h.

由表3可知，接種量對(duì)再造煙葉濃縮液中性香味成分含量影響顯著，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)其影響均不顯著.

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在最佳發(fā)酵條件下做了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)再造煙葉濃縮液在最佳條件下發(fā)酵前后的中性香味成分進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如表4所示.由表4可知，經(jīng)菌株HS-1發(fā)酵后，再造煙葉濃縮液中性香味成分總含量為72.527%，明顯高于正交試驗(yàn)中中性香味成分的總含量，其中，5-甲基糠醛和β-紫羅蘭酮為發(fā)酵后所產(chǎn)生的化合物;苯甲醇、苯乙醛、2-乙?；量?、苯乙醇、茄酮、β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮等成分均有不同程度增加，其中苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇、β-二氫大馬酮、β-大馬酮的含量分別是發(fā)酵前的3.6倍、2倍、2.2倍、1.8倍和1.6倍.因此，在發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為36 h的條件下，對(duì)再造煙葉濃縮液進(jìn)行發(fā)酵處理以提高中性香味成分的含量是可行的.

2.4 感官評(píng)吸結(jié)果

煙支感官舒適度各指標(biāo)評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表5.由表5可知，將經(jīng)增香菌適當(dāng)發(fā)酵處理后的再造煙葉濃縮液涂布于再造煙葉片基上，可提高卷煙的香氣質(zhì)和香氣量.

3 結(jié)論

本文從再造煙葉濃縮液中篩選到一株增香提高到72.527%.再造煙葉濃縮液經(jīng)菌株HS-1發(fā)酵處理后，中性香味成分的種類(lèi)和含量均有不同程度的增加，其中5-甲基糠醛和β-紫羅蘭酮為發(fā)酵后新增成分，苯甲醇、苯乙醛、2-乙?；量?、苯乙醇、茄酮、β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮等成分均有不同程度的增加.評(píng)吸結(jié)果表明，將經(jīng)增香菌HS-1發(fā)酵處理后的再造煙葉濃縮液涂布于再造煙葉片基上，可提高卷煙的香氣質(zhì)和香氣量.該研究獲得的增香菌HS-1能夠有效地改善再造煙葉的香氣品質(zhì)，其在再造煙葉增香領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力.

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