梁語(yǔ)嫣，彭梅，楊小生1,，陳發(fā)菊，羅忠圣，楊禮壽，鄧廷飛，王麗，王道平，楊娟1,***

(1．貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014)

消痛靈噴霧是本課題組研發(fā)的一種治療跌打損傷的中藥復(fù)方制劑，由透骨香、防風(fēng)等幾味藥材組成，透骨香在配方中作為君藥。透骨香Gaultheriayunnanensis(Franch.)Rehd 為杜鵑花科植物滇白珠全草或根[1]，有抑菌、抗氧化、活血通絡(luò)[2]、順氣平喘[3]的功效，被我國(guó)少數(shù)民族廣泛用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，透骨香中的水楊酸具有消炎鎮(zhèn)痛、殺菌等多重藥效作用，長(zhǎng)期以來一直作為臨床藥物被廣泛使用[6-7]，因此，在制備消痛靈工藝條件中，以配方中的水楊酸含量作為考察指標(biāo)。課題組的前期研究基礎(chǔ)表明，消痛靈噴霧劑的配方中主要含揮發(fā)油等成分，噴霧劑中的揮發(fā)性成分對(duì)小鼠跌打損傷也具有比較顯著的治療作用。因此為了保證消痛靈噴霧劑臨床療效的穩(wěn)定性和連續(xù)性，本研究在不破壞配方的揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上，沿用民間外敷或榨汁擦抹的方法，在制備工藝中采用乙醇為提取溶劑、冷浸法進(jìn)行提取，以透骨香中水楊酸為指標(biāo)，選擇4個(gè)因素運(yùn)用L9(43)正交實(shí)驗(yàn)，選出最佳制備工藝；并采用最佳工藝制備消痛靈噴霧，觀察該噴霧劑對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹、蛋清所致小鼠足腫脹及醋酸致小鼠扭體的影響，為藥物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)SCXK-(軍)2012-0011。

1.1.2藥物 透骨香、防風(fēng)等4種藥材(購(gòu)買于貴州貴陽(yáng)市萬東橋中藥材市場(chǎng))，貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。云南白藥氣霧劑(國(guó)字標(biāo)準(zhǔn)Z53021107)。

1.1.3試劑及儀器 冰醋酸(成都市科龍化工試劑廠)，食用乙醇、二甲苯(天津富宇精細(xì)化工公司)，水楊酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)NIC-100106)，甲醇(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，UV-1800型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)，JA2003精密電子天平(上海浦春劑量?jī)x器有限公司)，YLS-Q4型鼠耳打孔器(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-9]通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定水楊酸提取主要影響因素為乙醇濃度、料液比、滲漉時(shí)間及粉碎度，從而選取浸泡天數(shù)(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、粉碎度(D)作為考察因素，設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以水楊酸的含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(43)正交實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 消痛靈噴霧劑L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.1 Orthogonal test design of Xiaotongling spray L9 (43)

注：A為浸泡天數(shù)，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度。

1.2.2水楊酸含量測(cè)定[10-11]色譜柱為Gemini-Nx色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(甲醇與水為35 ∶65)，檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5.0 μL，理論板數(shù)按水楊酸計(jì)應(yīng)不低于3 000 。

1.2.3制備試藥 將透骨香、防風(fēng)等4味藥材按本課題組前期研究的藥材比例稱取共50.00 g，置于1 000 mL錐形瓶中，按工藝優(yōu)選后的乙醇濃度、料液比、浸泡時(shí)間，粉碎粒，依照冷浸法，過濾，稀釋為乙醇濃度40%，待用。消痛靈噴霧劑以優(yōu)選出最佳工藝制備作為高劑量(以含生藥材量計(jì)0.16 g/L)。

1.2.4二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 50只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性組(云南白藥噴霧劑)、消痛靈噴霧劑高、中、低劑量組(0.16、0.08及0.04 g/L)，將相應(yīng)藥物涂于小鼠耳部與腹部，3次/d，連續(xù)5 d。第5天各組小鼠右耳兩面均勻涂抹相應(yīng)藥物1 次，給藥30 min 后，各組小鼠右耳兩面均勻涂抹二甲苯30 μL，2 h后麻醉狀態(tài)下處死小鼠，剪下左右耳，用直徑8 mm 打孔器打下同一部位耳片，稱取質(zhì)量，計(jì)算腫脹率及抑制率[12-14]。

1.2.5對(duì)小鼠蛋清所致足腫脹的影響[15-17]分組及給藥時(shí)間同“1.2.4”，將各組相應(yīng)藥物涂于小鼠足部與腹部。末次給藥前以螺旋測(cè)微儀測(cè)量右后足跖厚度，作為致炎前右后足正常厚度，在末次給藥30 min 后，取10%(v/v)雞蛋清生理鹽水溶液0.1 mL于小鼠右后足跖中部皮下注射致炎并標(biāo)記，并記錄注完時(shí)間。分別測(cè)量各組小鼠致炎前后0.5、1及2 h右后足跖厚度，減去致炎前足跖厚度，計(jì)算足腫脹。

1.2.6醋酸扭體實(shí)驗(yàn)[18-20]分組及給藥時(shí)間同“1.2.4”，各組小鼠腹部去毛，暴露2 cm×2 cm的皮膚為給藥區(qū)。末次給藥30 min后，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸0.2 mL，記錄注射后15 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)及方差分析

以表2中的極值R進(jìn)行分析，各指標(biāo)因素影響的主次順序是A>B>C>D，根據(jù)K值進(jìn)行比較可得，A因素中K3值最大，B因素中K2值最大，C因素中K2值最大，D因素中K1值最大。表3中，將離差平方和中最小的項(xiàng)近似作為誤差的估計(jì)，用來計(jì)算各因子列的F比值，可以看出A因素的3個(gè)水平存在較大差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響較大，B、C和D因素的3個(gè)水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，結(jié)合表3方差分析可以得出最佳提取工藝為A3B2C2D1，即最佳方案：浸泡時(shí)間為7 d、濃度為75%乙醇、液料比為 1 ∶5，藥材過10目篩大小，使用時(shí)將配置出的配方稀釋至含乙醇濃度為40%即可。

2.2 消痛靈噴霧對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

結(jié)果顯示，不同劑量組治療后的腫脹抑制率存在差異，各治療組均有抑制作用，其中中劑量組顯著抑制二甲苯所致耳廓腫脹，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且腫脹率、抑制率接近陽(yáng)性組。見表4。

表2 消痛靈噴霧劑L9(43)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal test results of xiaotongling spray L9 (43)

注：A為浸泡天數(shù)，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度，R為同列Ki的極值。

表3 消痛靈噴霧劑制備工藝方差分析表Tab.3 Variance analysis table of preparation process of xiaotongling spray

注：A為浸泡天數(shù)，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度。

表4 消痛靈噴霧劑對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.4 Effects of xiaotongling spray for xylene-induced ear swelling in mice

注：“-”為不做計(jì)算，(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.3 消痛靈噴霧對(duì)蛋清致小鼠足腫脹影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，消痛靈噴霧劑高、中劑量組給藥30 min及給藥90 min，高劑量組給藥60 min，小鼠足趾腫脹度均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 消痛靈噴霧劑對(duì)蛋清致小鼠足跖腫脹的影響Tab.5 Effects of xiaotongling spray for egg white-induced paw swelling in

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

2.4 消痛靈噴霧對(duì)醋酸所致小鼠疼痛的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各治療組均能在一定程度上抑制醋酸所致的疼痛反應(yīng)，注射后15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)減少，但與空白對(duì)照組比較，僅高劑量組小鼠扭體次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明消痛靈噴霧劑對(duì)醋酸引起的疼痛有顯著的抑制作用。見表6。

表6 消痛靈噴霧劑對(duì)醋酸致小鼠疼痛的影響Tab.6 Effects of xiaotongling spray one pain

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

炎癥是人類疾病中最廣泛、最常見的病理過程，是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)局部損傷的反應(yīng)。許多研究證明，炎癥的發(fā)生往往伴隨著疼痛反應(yīng)，并相互影響。本研究中的消痛靈噴霧劑為透骨香，防風(fēng)等幾味藥材組成的復(fù)方制劑，其中透骨香中的水楊酸作為一種具有廣泛活性的化合物，與阿司匹林的結(jié)構(gòu)母核一致，具有相應(yīng)非甾體抗炎類藥物的藥效特征，很早就已被中國(guó)、日本及美國(guó)等多個(gè)國(guó)家藥典收錄[21-22]，因此選作消痛靈噴霧劑工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)?？紤]到組方藥材中含有揮發(fā)性物質(zhì)，因此采用冷浸法對(duì)其制備，以減少有效物質(zhì)損失[23]。課題組的前期研究基礎(chǔ)表明，消痛靈噴霧劑的配方中主要含揮發(fā)油等成分，噴霧劑中的揮發(fā)性成分對(duì)小鼠跌打損傷也具有比較顯著的治療作用。因此為了保證消痛靈噴霧劑臨床療效的穩(wěn)定性和連續(xù)性，以及進(jìn)一步對(duì)消痛靈噴霧劑藥效學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。本研究在不破壞配方的揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上，沿用民間外敷或榨汁擦抹的方法，制備工藝中采用乙醇為提取溶劑，冷浸法進(jìn)行提取，以透骨香中水楊酸為指標(biāo)，選擇4個(gè)因素運(yùn)用L9(43)正交實(shí)驗(yàn)，篩選其最佳制備工藝，得出消痛靈噴霧劑的最佳提取工藝為A3B2C2D1，即最佳方案為浸泡時(shí)間為7 d、濃度為75%乙醇、液料比為1 ∶5，藥材過10目篩大小，使用時(shí)將配置出的配方稀釋至含乙醇濃度為40%即可。

為了研究最優(yōu)工藝條件制備的消痛靈噴霧對(duì)小鼠消炎及鎮(zhèn)痛效果，本研究選用的2種炎癥動(dòng)物模型(小鼠足腫脹及小鼠耳腫脹)，屬于急性炎癥模型，可引起組胺、5羥色胺(5-HT)等炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致局部毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)、滲出和水腫，紅、腫、熱、痛等早期急性炎癥表現(xiàn)[24-25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，消痛靈噴霧劑中劑量組顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，同時(shí)，高、中劑量組從致炎30 min開始可明顯抑制足腫脹可持續(xù)到90 min，表明消痛靈噴霧劑具有較強(qiáng)抗炎作用。在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，高劑量組能明顯減少醋酸致小鼠能扭體次數(shù)，且其抑制率與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。

綜上所述，消痛靈噴霧劑的制備工藝為，浸泡時(shí)間7 d、75%濃度乙醇、液料比為 1 ∶5、藥材過10目篩大小，在最佳工藝條件下制備的消痛靈噴霧劑具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，為該產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。