李抄，陳定宇，張曉怡，趙艷，王琴容，周建獎，謝淵

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點實驗室，貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤。據(jù)2018年全球流行病學(xué)資料顯示，全球胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位，死亡率居第5位；在中國，胃癌的發(fā)病率和死亡率分別占全部腫瘤的第4位和第2位[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個方面，主要包括宿主遺傳學(xué)、環(huán)境因素和幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)感染[3]。Hp是一種螺旋狀革蘭陰性微需氧菌，它定殖在人類的胃黏膜上皮，是引起胃炎、消化性潰瘍、胃癌的主要病因。Hp的發(fā)現(xiàn)加深了人類對慢性感染、炎癥和癌癥之間關(guān)系的認(rèn)知，1994年世界衛(wèi)生組織將Hp列為 I 類致癌因子[4-5]。全世界有近半數(shù)人感染Hp，但僅少數(shù)會發(fā)展成胃癌，究其原因，除宿主與環(huán)境因素外，HpcagA毒力表達是導(dǎo)致其感染后不同臨床結(jié)局的可能原因[6]。細胞毒素相關(guān)基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,cagA )是由HpcagA致病島編碼的一種120～145 kDa的蛋白質(zhì)，通過IV型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，TFSS)注入胃上皮細胞，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，是目前所知的唯一被Hp注入胃上皮細胞并能模擬細胞內(nèi)蛋白發(fā)揮作用的“癌蛋白”(oncoprotein)，但其致癌機制還不完全清楚[7-9]?；虼虬?gene targeting)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，是利用基因轉(zhuǎn)移方法將外源DNA序列導(dǎo)入靶細胞后，通過外源DNA 序列與靶細胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組，將外源DNA定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，或?qū)δ骋活A(yù)先確定的靶位點進行定點突變，從而改變細胞遺傳特性的方法[10-11]。目前基因打靶技術(shù)已應(yīng)用在改造生物、培育新的生物品種，研究基因結(jié)構(gòu)與功能、表達與調(diào)控，研究細胞生活周期調(diào)控機制，遺傳病的基因治療等多方面。為進一步明確cagA在Hp致胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實驗運用基因打靶技術(shù)構(gòu)建敲除cagA基因的Hp突變株，為后續(xù)研究cagA致病機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

1.1.1材料 pACYC184質(zhì)粒、pUCmT載體及細菌DNA提取試劑盒(上海生工生物公司)，幽門螺桿菌HP1004及胃癌原代細胞(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點實驗室保存)。

1.1.2主要試劑和儀器 雙抗(美國 HyClone公司)，改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco 公司)，氯霉素(chloramphenicol，Cm，中國 Beyotime公司)，哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)，Taq DNA聚合酶和T4 DNA ligase(日本TAKARA公司)，anti-cagAantibody和anti-GAPDHantibody(美國CST公司)；電轉(zhuǎn)化儀Electroporator 2510(中國 Eppendorf)，全制動化學(xué)發(fā)光成像分析儀(中國 上海天能科技公司)；Primer5.0設(shè)計引物合成于上海生工，見表1。

1.2 方法

1.2.1cagA基因的上、下游同源重組臂擴增 高保真PCR酶從Hp基因組上擴增cagA基因的上、下游同源重組臂，反應(yīng)體系為50 μL[Hp基因組DNA 0.5 μL、10×pfu buffer 5 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL、cagA-5F/3F及cagA-5R/3R (5×10-6mol/L)各0.5 μL，pfu DNA polymerase(5×10-3U/L) 0.5 μL，DMSO(5%) 2.5 μL，ddH2O補足體積]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)循環(huán)程序為95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，5個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2Cm的表達框序列擴增 從pACYC184質(zhì)粒上擴增Cm的表達框序列，Cm抗性基因的擴增反應(yīng)體系為50 μL：pACYC184質(zhì)粒DNA 0.5 μL，10×pfu buffer 5 μL，dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL，cagA-Cm-F和cagA-Cm-R (5×10-6mol/L)各0.5 μL，pfu DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL，ddH2O 補足；PCR循環(huán)程序同方法1.2.1。

1.2.3融合PCR構(gòu)建打靶片段cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設(shè)計與Cm抗性基因序列有部分重疊，可通過PCR直接融合，獲得全長的打靶片段。反應(yīng)總體系100 μL：上、下游同源重組臂PCR產(chǎn)物、Cm抗性基因PCR產(chǎn)物、5%DMSO各5 μL，10×pfu buffer 10 μL、dNTP(2.5×10-2mol/L)、cagA-5F、cagA-3R (5×10-6mol/L)及pfu DNA polymerase(5×10-6U/L)各1 μL，dH2O補足；PCR循環(huán)程序同方法1.2.1，循環(huán)數(shù)為25次。

1.2.4打靶載體(pUCmT-ΔcagA::Cm)的構(gòu)建 在打靶片段PCR產(chǎn)物中直接加入Taq DNA聚合酶(5×10-6U/L)，于72 ℃反應(yīng)30 min電泳并切膠純化后與然后與50 mg/L pUCmT載體進行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL：pUCmT(5×107ng/L) 2 μL，打靶片段(5×107ng/L) 6 μL，10×T4 buffer 1 μL，T4 DNA ligase(5×10-6U/L) 1 μL；16 ℃反應(yīng)過夜。

1.2.5打靶載體的電轉(zhuǎn)化 取4 mL液體培養(yǎng)(布氏肉湯加10%胎牛血清)的Hp分裝于2 mL無菌Ep管中，4 ℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體；等體積無菌去離子水輕柔吹打洗滌，4 ℃、6 000 r/min離心5 min收集菌體，相同方法重復(fù)洗滌1次；用100 μL無菌10%甘油輕柔懸浮菌體，取40 μL分裝在預(yù)冷的0.5 mL無菌Ep管中即可用作電轉(zhuǎn)化細胞。取500 ng預(yù)冷的打靶質(zhì)粒加入40 μL新鮮制備的電轉(zhuǎn)化細胞，4 ℃放置2 min，轉(zhuǎn)移入2 mm Eppendorf電擊轉(zhuǎn)化杯，迅速放入電轉(zhuǎn)化儀，2 500 V電壓下電擊轉(zhuǎn)化；加入Hp培養(yǎng)液1 mL懸浮菌體，轉(zhuǎn)入50 mL無菌尖底離心管，加入液體培養(yǎng)基5 mL，2.5 L厭氧罐內(nèi)37 ℃、100 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.6cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的篩選 吸取500 μL打靶載體電轉(zhuǎn)化后的細菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接5 mL液體培養(yǎng)液(含Cm 2×10-2μg/L)，于上述同樣培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，直至培養(yǎng)液渾濁；取微量渾濁培養(yǎng)液劃線接種固體培養(yǎng)基(Karmali培養(yǎng)基，加10%脫纖維綿羊血和2×10-2μg/L Cm)，于微需氧厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)至單克隆形成。

1.2.7cagA基因敲除菌株Hp/ΔcagA::Cm的PCR鑒定 隨機挑選若干陽性克隆，分別接種3 mL布氏肉湯(含10%胎牛血清)，厭氧罐條件下37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至菌體明顯渾濁，取少量菌液進行PCR擴增；用cagA外側(cè)引物擴增時，如cagA基因未被替換，PCR產(chǎn)物長度為5 014 bp；而打靶載體替換成功時，產(chǎn)物長度則縮短為2 150 bp；反應(yīng)體系50 μL：基因組DNA 0.5 μL，10×TaqPlus buffer 5 μL，dNTP(2.5×10-2mol/L) 0.5 μL，cagA-outF及cagA-outR(5×10-6mol/L)各0.5 μL，5% DMSO 2.5 μL，Taq Plus DNA polymerase(5×10-6U/L) 0.5 μL及ddH2O 補足；PCR循環(huán)程序同方法1.2.1，循環(huán)數(shù)為35次，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.8原代胃癌細胞培養(yǎng)及Hp/ΔcagA::Cm、Hp/cagA感染原代胃癌細胞 按1.0×106/孔細胞數(shù)量接種于含DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS)6孔板中，37 ℃的 5%CO2孵育箱常規(guī)培養(yǎng)，感染前將6孔板中換成無雙抗含Gibco血清培養(yǎng)基；Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA培養(yǎng)3 d，感染復(fù)數(shù)(mutiplicity of infection，MOI) 30 ∶1的比例分別感染原代胃癌細胞，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并分別收集各組細胞，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.9Western blot檢測原代胃癌細胞內(nèi)cagA存在 按全蛋白提取試劑盒進行細胞全蛋白提取，按BCA蛋白含量檢測試劑盒進行蛋白定量，10%PAGE分離蛋白，上樣蛋白體積20 μL，電泳，濕轉(zhuǎn)PVDF膜，5% 脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育cagA一抗(1 ∶1 000/4 000)過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST清洗3次，按化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進行反應(yīng)，利用熒光凝膠成像系統(tǒng)曝光、顯影及分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，Graphpad Prism 7.0軟件繪圖，組間比較使用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 融合PCR構(gòu)建打靶片段鑒定

cagA基因上、下游同源重組臂經(jīng)設(shè)計與Cm抗性基因序列有部分重疊，可通過PCR直接融合，獲得全長的打靶片段，長度為1 794 bp，見圖1。

注：1為打靶片段，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照(DNA Maker)。圖1 打靶片段融合PCR結(jié)果Fig.1 Target fragment fusion PCR map

2.2 Hp/ΔcagA::Cm突變株P(guān)CR鑒定

PCR擴增鑒定結(jié)果顯示，Hp/ΔcagA::Cm陽性克隆擴增產(chǎn)物為2 150 bp，野生型Hp/cagA菌株擴增產(chǎn)物為5 014 bp，表明成功獲得Hp/ΔcagA::Cm敲出突變菌株，見圖2。

注：1為野生Hp/cagA菌株，2為 Hp/ΔcagA::Cm突變株，M 為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2 Hp/ΔcagA::Cm突變株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.2 Hp/ΔcagA::Cm mutant PCR identification map

2.3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染的原代胃癌細胞形態(tài)

Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA分別感染3株胃癌原代細胞，24 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，可見感染野生型Hp/cagA的原代胃癌細胞發(fā)生明顯的細胞形態(tài)改變，由鈍圓變?yōu)殚L梭形、紡錘形、不規(guī)則形，細胞死亡數(shù)量多，感染Hp/ΔcagA::Cm突變株的細胞形態(tài)改變較小，死亡細胞數(shù)量少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

注：A為Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染3株胃癌原代細胞，B為細胞數(shù)量的直條圖；(1)與WZKHp/cagA,YHDHp/cagA組比較，P<0.01;(2)與HZMHp/cagA組比較，P<0.05。圖3 Hp/ΔcagA::Cm和Hp/cagA感染細胞形態(tài)改變 (100×)Fig.3 Hp/ΔcagA::Cm and Hp/cagA infected cell morphology changes (100×)

2.4 原代胃癌細胞內(nèi)cagA蛋白表達

Western blot檢測cagA蛋白(分子量135 kDa)表達情況，結(jié)果表明野生型Hp/cagA菌株及其感染3株原代細胞內(nèi)cagA蛋白表達水平較Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株及其感染3株原代細胞明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

注：A為Western blot檢測cagA蛋白條帶，B為cagA蛋白表達量的條圖；(1)與HZMHp/ΔcagA::Cm組比較，P<0.01；(2)與WZKHp/ΔcagA::Cm組比較，P<0.01；(3)與YHDHp/ΔcagA::Cm組比較，P<0.01；(4)與Hp/ΔcagA::Cm組比較，P<0.01。圖4 細菌及其感染細胞內(nèi)cagA 表達情況Fig.4 CagA expression in bacteria and infected cells

3 討論

全球約50%人口存在Hp感染，多數(shù)感染患者為無癥狀胃炎，少數(shù)發(fā)展為萎縮性胃炎甚至胃癌[12]。cagA是HP感染引起炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)蛋白，被Hp注入胃上皮細胞的cagA發(fā)生磷酸化，磷酸化的cagA和Scr同源區(qū)2結(jié)合激活Scr同源區(qū)的磷酸化酶活性，從而引起瀑布式的級聯(lián)反應(yīng)；通過干擾細胞信息傳導(dǎo)通路引起組織嚴(yán)重的炎癥損傷，參與胃癌的形成過程[13]。cagA可引起胃癌細胞的增殖和凋亡紊亂[14]。臨床檢出的Hp包括cagA陽性和cagA陰性2種類型；cagA陽性Hp感染患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險高于cagA陰性者[15]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為cagA與Hp引起疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)；Hp/cagA+菌株可引起更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，更容易引起胃萎縮和胃腺癌的發(fā)生，是Hp/cagA-菌株的2.0～28.4倍[16-17]；因此cagA在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。為了更好地研究Hp中cagA蛋白的致病功能，通過基因打靶的同源重組原理構(gòu)建了HpΔcagA基因缺失突變株，為系統(tǒng)研究cagA基因功能創(chuàng)造了條件，也為進一步闡明Hp致病機制奠定基礎(chǔ)。

基因打靶是分析基因功能的重要技術(shù)，用于定位功能基因，研究模式生物和一些重要微生物的全基因組功能，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域[18]?；虼虬屑夹g(shù)以同源重組為理論基礎(chǔ)，同源重組機制在原核和真核生物中普遍存在，是保證物種遺傳信息穩(wěn)定性和多樣性的一種重要機制[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，新的遺傳物質(zhì)可以通過同源重組引人生物細胞的基因組，井對基因進行特異性修飾和改造[20-22]；也有研究報道，構(gòu)建出了cagA全基因缺失的Hpylori突變株[23-24]，本研究利用高保真PCR酶從Hp基因組上擴增cagA基因的上、下游同源重組手臂；從pACYC184質(zhì)粒上擴增Cm表達框序列。通過融合PCR技術(shù)獲得cagA基因敲除用的打靶片段(上游同源手臂-氯霉素抗性基因-下游同源手臂)，將其克隆入通用載體pUCmT，獲得打靶載體pUCmT-ΔcagA::Cm。然后通過電轉(zhuǎn)化，將pUCmT-ΔcagA::Cm質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入Hp，在抗生素壓力的幫助下，打靶片段和菌體基因組發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性篩選得到帶有抗性標(biāo)記的重組菌，隨后因突變載體不能在Hp1004菌體內(nèi)生長復(fù)制而丟失。

檢測突變株Hp/ΔcagA::Cm是否還存cagA基因或蛋白，是最后認(rèn)證cagA基因缺失突變株構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵。本研究對Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株和野生型Hp/cagA菌株的基因組進行了PCR鑒定，用cagA外側(cè)引物擴增時，野生株可以擴出完整的cagA基因和非編碼序列的長約5 014 bp，而cagA缺失突變株cagA基因被打靶載體替換，產(chǎn)物長度則縮短為2 150 bp。另外本研究用Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株和野生型Hp/cagA菌株感染原代胃癌細胞，Western blot實驗均能從野生型Hp/cagA菌株及其感染細胞檢出cagA蛋白，而Hp/ΔcagA::Cm突變型菌株及其感染細胞內(nèi)均不能檢出cagA蛋白，從而在蛋白水平上證實了上述實驗結(jié)果，表明本次cagA缺失突變株Hp/ΔcagA::Cm構(gòu)建成功。同時本研究還發(fā)現(xiàn)感染野生型Hp/cagA的原代胃癌細胞發(fā)生明顯的細胞形態(tài)改變，由鈍圓變?yōu)殚L梭形、紡錘形及不規(guī)則形，細胞死亡數(shù)量多，而感染Hp/ΔcagA::Cm突變株的細胞形態(tài)改變較小、死亡細胞數(shù)量少；這進一步證實cagA被Hp注入細胞后對細胞有一定的毒性作用。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了Hp/ΔcagA::Cm突變株，并在感染細胞中成功驗證，且證實cagA蛋白對細胞有一定的毒性作用，為進一步研究Hp中cagA基因的功能，闡明其在Hp致病中的地位及作用奠定了實驗基礎(chǔ)。