陶文玉，李傳印，楊瑩，楊曼，王曉苓，角銘，何思琦，洪超，李奕平**

(1.云南省第二人民醫(yī)院 &昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，云南 昆明 650021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 &北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)糖尿病發(fā)病率已達(dá)10.9%[1]，T2DM個(gè)體約占糖尿病總數(shù)的90%以上。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM可能是由遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致[2]。人類基因組序列中75%具有轉(zhuǎn)錄活性[3]，而基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中非編碼RNA(non coding RNA，ncRNA)占絕大多數(shù)[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200nt ncRNA，可作為信號(hào)分子參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA蛋白復(fù)合物在胞質(zhì)的定位以及分子裝配等多種生物學(xué)過(guò)程以及基因表達(dá)調(diào)控[5-6]，目前已成為疾病的新型生物標(biāo)記分子或治療靶點(diǎn)[7]。研究顯示 lncRNA在糖代謝中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[8-10]，而在T2DM和非糖尿病患者中l(wèi)ncRNA存在表達(dá)差異[11]。位于lncRNA基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可通過(guò)影響lncRNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，影響其表達(dá)或改變其功能，這可能會(huì)影響疾病易感性[12-13]。近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies，GWAS)結(jié)果已顯示lncRNA基因多態(tài)性可能與T2DM相關(guān)[14-15]。本研究選取PROX1-AS1基因rs2075423和PRICKLE2-AS1基因rs12497268的lncRNA多態(tài)性位點(diǎn)，分析其與中國(guó)漢族人群T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2012年2月-2018年2月在云南省第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的784名T2DM患者(男495例、女289例)為T(mén)2DM組，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO，1999年)診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)糖尿病癥狀+空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血漿血糖≥11.1 mmol/L，(2)若無(wú)糖尿病癥狀，需兩次血糖檢測(cè)異常。隨機(jī)選取846名參加體檢的非糖尿病個(gè)體(男503、女343)作為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)FPG≥6.1 mmol/L和(或)糖化血紅蛋白(glycosylated haemoglobin，HbA1C)≥6.2%的個(gè)體，(2)糖尿病家族史陽(yáng)性個(gè)體，(3)高血壓病和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病個(gè)體。本研究在實(shí)施前獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有參加者均是中國(guó)漢族，實(shí)驗(yàn)前均簽署知情同意書(shū)，相互之間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2 研究方法

1.2.1臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目 空腹12 h清晨抽靜脈血，采用HITACHI 自動(dòng)分析儀7600-020測(cè)定FPG；用酶法測(cè)定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)；免疫比濁法測(cè)定HbA1C。

1.2.2DNA提取 使用血DNA提取試劑盒(QIAamp Blood Mini Kit，Qiagen)抽提基因組DNA。

1.2.3基因型測(cè)定 采用質(zhì)譜法(MassArray Analyzer 4.0,Agena,Inc)對(duì)PROX1-AS1基因rs2075423，PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型進(jìn)行分型，采用AssayDesigner 3.1(Sequenom lnc.,San Diego,CA,USA)設(shè)計(jì)待檢SNP的PCR引物。待檢SNP基因片段的PCR反應(yīng)在384孔板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為5 μL(PCR混懸液4 μL及25 mg/LDNA模板1 μL)。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共45個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 長(zhǎng)延伸3 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)處理，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)樹(shù)脂純化后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000設(shè)備(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)將終產(chǎn)物轉(zhuǎn)到SpectroCHIP的384孔反應(yīng)板。使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析儀(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)對(duì)SpectroCHIP結(jié)果進(jìn)行讀取，TYPER4.0 s軟件獲得原始基因型數(shù)據(jù)。為保證質(zhì)譜分析法對(duì)基因型檢測(cè)的準(zhǔn)確性，每一塊384孔反應(yīng)板中加入3個(gè)已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)，用水代替DNA模板作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 入選個(gè)體的臨床特征

入選個(gè)體的臨床特征見(jiàn)表1。T2DM組和對(duì)照組年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組個(gè)體的糖脂代謝指標(biāo)(TC、TG、LDL-C、FPG及HbA1C)顯著高于對(duì)照組個(gè)體；而HDL-C顯著低于對(duì)照組個(gè)體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示糖脂代謝紊亂為T(mén)2DM的特征。

2.2 rs2075423及rs12497268等位基因和基因型在兩組中的分布特征

PROX1-AS1基因中的rs2075423位點(diǎn)及PRICKLE2-AS1基因中的rs12497268位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在兩組中的分布特征見(jiàn)表2。哈-溫平衡分析顯示，2個(gè)SNP位點(diǎn)在對(duì)照組和T2DM組均符合哈-溫平衡(P>0.05)，說(shuō)明本研究樣本符合群體代表性。對(duì)2個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因和基因型在T2DM組合對(duì)照組的分布差異分析的結(jié)果顯示，PROX1-AS1基因rs2075423的等位基因和基因型頻率在T2DM組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001或P=0.002)，該為點(diǎn)等位基因G可能是T2DM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=1.394,95%CI為1.153～1.686)。而PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型頻率及等位基因頻率在T2DM組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 T2DM組和對(duì)照組一般臨床資料比較Tab.1 The clinical characteristics of the subjects in T2DM and control groups

2.3 顯性遺傳模式下rs2075423及rs12497268與T2DM的相關(guān)性

采用邏輯回歸方法分析PROX1-AS1基因中多態(tài)性位點(diǎn)rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多態(tài)性位點(diǎn)rs12497268在顯性遺傳模式下與T2DM的風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，再現(xiàn)性遺傳模式下，rs2075423位點(diǎn)的基因型G/G相對(duì)于基因型G/T+T/T來(lái)說(shuō)可能是T2DM的風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.001,OR=1.488;95%CI為1.197～1.851)。同樣，在顯性遺傳模式下，rs12497268位點(diǎn)基因型G/G相對(duì)于基因型基因型G/C+C/C來(lái)說(shuō)可能是T2DM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素(P=0.027,OR=1.260;95%CI為1.027～1.545)，見(jiàn)表3。

3 討論

T2DM是多基因遺傳的代謝性疾病，大量研究已經(jīng)證實(shí)ncRNA在T2DM發(fā)生、發(fā)展中扮演重要作用[17-18]，同時(shí)，相關(guān)性研究顯示位于ncRNA基因的SNP位點(diǎn)可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性[19-21]。2012年，以歐洲人群為主要研究對(duì)象，Morris等[22]對(duì)34 840例T2DM個(gè)體和114 981例對(duì)照的聯(lián)合meta分析提示，PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G為T(mén)2DM的危險(xiǎn)因素(P=8.1×10-9;OR為1.07,95%CI為1.05～1.10)。2014年，對(duì)4個(gè)群體(歐洲人群、東亞人群、南亞人群、墨西哥和墨西哥裔美國(guó)人群)GWAS的meta分析總結(jié)提示，無(wú)論是以上4個(gè)群體中任何1個(gè)群體，還是4個(gè)群體的聯(lián)合分析，rs2075423G均為T(mén)2DM的風(fēng)險(xiǎn)等位基因[23]。不僅是病例對(duì)照研究，同年，歐洲癌癥和營(yíng)養(yǎng)狀況前瞻性隊(duì)列研究也報(bào)道，rs2075423等位基因G發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)比為1.03。本研究分析了該SNP與中國(guó)漢族人群T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，結(jié)果顯示PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G可能是T2DM的風(fēng)險(xiǎn)因素。以上研究結(jié)果說(shuō)明lncRNAPROX1-AS1基因rs2075423可能與T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，鑒于PROX1-AS1為非編碼RNA，因此本研究推測(cè)rs2075423位點(diǎn)與T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的分子機(jī)制可能是通過(guò)影響lncRNAPROX1-AS1的表達(dá)或其與靶基因的相互作用。

表2 PROX1-AS1基因中rs2075423位點(diǎn)及PRICKLE2-AS1基因中rs12497268位點(diǎn)的等位基因和基因型在T2DM組和對(duì)照組的分布特征Tab.2 The allelic and genotypic distribution of rs2075423 and rs12497268 in T2DM and control groups

表3 顯性遺傳模式下PROX1-AS1基因中多態(tài)性位點(diǎn)rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多態(tài)性位點(diǎn)rs12497268Tab.3 rs2075423 and rs12497268 with T2DM under dominant inheritance pattern

注：(1)P值經(jīng)年齡和性別校正。

而2012年，Morris等[22]對(duì)歐洲人群的研究顯示，PRICKLE2-AS1基因rs12497268等位基因G是T2DM的危險(xiǎn)因素(P=2.1×10-2,OR=1.03;95%CI為1.01～1.07)。而本研究結(jié)果顯示，該位點(diǎn)等位基因可能與中國(guó)漢族人群T2DM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性。相似地，2019年，Kasuga等[24]對(duì)日本213名妊娠期糖尿病個(gè)體產(chǎn)前、產(chǎn)后葡萄糖耐受情況及其遺傳特征進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，遺傳特征可能是日本婦女妊娠糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，而rs12497268妊娠糖尿病無(wú)相關(guān)性。以上研究結(jié)果的不一致說(shuō)明rs12497268在不同人群中發(fā)揮的作用可能不同，除此之外，不同研究納入樣本量的差異也有可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，該位點(diǎn)在T2DM發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮的作用需要更多的相關(guān)性研究來(lái)揭示。

綜上所述，本研究選取了兩個(gè)lncRNA基因中的SNP位點(diǎn)，研究其與中國(guó)漢族人群T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示PROX1-AS1基因rs2075423等位基G因和基因型G/G以及PRICKLE2-AS1基因rs12497268 基因型G/G可能是T2DM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果說(shuō)明，lncRNA基因中的SNP位點(diǎn)可能與T2DM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這可能是通過(guò)影響成熟lncRNA的表達(dá)以及改變lncRNA的功能實(shí)現(xiàn)的。鑒于lncRNA在T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用，而lncRNA基因中的SNP位點(diǎn)可能會(huì)影響lncRNA在T2DM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮的作用，因此，lncRNA基因中的SNP位點(diǎn)有望成為T(mén)2DM的分子標(biāo)記之一。