趙華，宗春燕，周振，曹毅

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

睪丸是對(duì)微波輻射和電磁脈沖敏感的器官之一[1]。移動(dòng)電話作為當(dāng)今社會(huì)主要的通信工具，其對(duì)生殖系統(tǒng)的影響是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)之一，有學(xué)者研究了微波輻射對(duì)睪丸組織、精子形態(tài)及數(shù)量的影響[2-5]，本課題前期研究證實(shí)了雄性SD大鼠血漿睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)和褪黑素(melatonin，Mel)存在明顯晝夜節(jié)律，在大鼠自發(fā)活動(dòng)的峰值或谷值時(shí)點(diǎn)給予 900 MHz 2 000 μW/cm2微波輻射能夠影響大鼠血漿激素水平的晝夜節(jié)律性[6]。為維持機(jī)體正常功能，血漿激素水平穩(wěn)定是非常重要的，本研究以血漿Mel具有明顯晝夜節(jié)律性的大鼠為模型，探討微波輻射影響晝夜節(jié)律的敏感時(shí)間，檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)微波輻射對(duì)大鼠血漿Mel和T水平的影響程度，為研究微波輻射對(duì)生殖系統(tǒng)的影響和防護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

PMM8053A場(chǎng)強(qiáng)儀(意大利PMM公司)，自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)。電磁輻射系統(tǒng)：GTEM室(長(zhǎng)5.67 m、寬2.83 m、高2.07 m，型號(hào)DN6313A，蘇州大學(xué)研制)，功率放大器(型號(hào)SN1012，HD Communications Corp)和信號(hào)發(fā)生器(型號(hào)SN2130J6030，意大利PMM公司)。物節(jié)律單余弦模型分析軟件(蘇州大學(xué))，有機(jī)玻璃輻射盒，睪酮和MelELISA試劑盒(購(gòu)于上海易利生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物及分組 由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量(150±10)g，根據(jù)大鼠24 h自發(fā)活動(dòng)晝夜節(jié)律篩選出87只、根據(jù)大鼠血漿Mel水平24 h晝夜節(jié)律篩選出60只晝夜節(jié)律無(wú)明顯性差異的大鼠，隨機(jī)分為照射組和對(duì)照組；照射組和對(duì)照組再各分為6個(gè)小組(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM)、每組5只。大鼠在環(huán)境溫度20～26 ℃、濕度40%～70%下適應(yīng)性喂養(yǎng)30 d，自由飲水進(jìn)食，光照/黑暗(12 h ∶12 h)。通過自發(fā)活動(dòng)系統(tǒng)采集大鼠24 h自發(fā)活動(dòng)數(shù)據(jù)，再運(yùn)用生物節(jié)律單余弦分析軟件選擇87只具有明顯晝夜節(jié)律的大鼠，24 h尾靜脈采血6次、每次間隔4 h，測(cè)血漿Mel水平，分析Mel水平的24 h晝夜節(jié)律。

1.2.2活動(dòng)觀察 觀察室內(nèi)放置4個(gè)大小為50 cm×50 cm×70 cm的隔光、隔聲、獨(dú)立的有機(jī)玻璃盒，盒內(nèi)設(shè)飲水?dāng)z食裝置；觀察室內(nèi)配有獨(dú)立開關(guān)的紅外線光源、人工白熾燈光源和攝像頭，可拍攝大鼠的活動(dòng)軌跡，視頻信息輸入電腦并通過軟件分析得到大鼠自發(fā)活動(dòng)平均速度。大鼠放入觀察室內(nèi)保持與外界隔光狀態(tài)，適應(yīng)1 d，觀察24 h。每4 h攝像1次，每次觀察30 min，然后分析24 h內(nèi)不同時(shí)間段大鼠自發(fā)活動(dòng)的平均速度。

1.2.3微波輻射 大鼠在有機(jī)玻璃輻射盒中通過微波輻射系統(tǒng)進(jìn)行全身照射[6]，各組分別于2 ∶00 PM、6 ∶00 PM、10 ∶00 PM 、2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 AM 時(shí)間點(diǎn)連續(xù)暴露1 h于2 000 μW/cm2900 MHz微波輻射環(huán)境中，每組1 h/d、共30 d；同時(shí)點(diǎn)放置對(duì)照組于有機(jī)玻璃盒中進(jìn)行微波輻射假暴露(假暴露即為除不給予微波輻射外，其余同照射組相同)，1 h/d，其他飼養(yǎng)條件同照射組。

1.2.4血漿激素水平測(cè)定 所有大鼠在暴露結(jié)束后第0、4、8、12、16和20 h時(shí)尾靜脈采血，離心15 min(1 500 r/min)，4 ℃保存，用ELISA法測(cè)定血漿T和Mel水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1余弦分析 用生物節(jié)律單余弦模型分析軟件進(jìn)行分析，根據(jù)方程公式F(t)=M+Acos(ωt+Φ)擬合相位響應(yīng)曲線(振幅A為上下波動(dòng)的幅度、節(jié)律振蕩的幅度，M為漲落變化的中線、節(jié)律的調(diào)整中值，ω為節(jié)律的角頻率15°/h，Φ為振蕩到達(dá)頂峰的時(shí)刻、又稱為峰值相位，是最穩(wěn)定的節(jié)律特征參數(shù))，分析曲線時(shí)相變化確定是否存在晝夜節(jié)律，即對(duì)振幅A作F檢驗(yàn)[7]。將大鼠6個(gè)時(shí)點(diǎn)血漿中Mel和T的水平用上述分析軟件擬合出相位響應(yīng)曲線再進(jìn)行分析，此分析方法可分為組平均余弦法和單一余弦法。用生物節(jié)律單余弦模型分析軟件進(jìn)行相位響應(yīng)曲線擬合每組動(dòng)物6個(gè)時(shí)點(diǎn)激素水平的均值，得到各組大鼠的相位響應(yīng)曲線，以描述各組節(jié)律特征，即為組平均余弦法；單一余弦法則是對(duì)每只大鼠6個(gè)時(shí)點(diǎn)的激素水平進(jìn)行擬合分析，得到每只大鼠的A、M和Φ這3個(gè)參數(shù)，然后對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 微波輻照前大鼠晝夜節(jié)律指標(biāo)

照射組和對(duì)照組微波輻射前血漿Mel水平晝夜節(jié)律的3個(gè)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)表1中血漿Mel水平晝夜節(jié)律相位響應(yīng)曲線振幅A作F檢驗(yàn)，照射組和對(duì)照組血漿Mel水平均具有明顯晝夜節(jié)律，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 輻照前大鼠血漿Mel水平晝夜節(jié)律指標(biāo)(n=5)Tab.1 Circadian rhythmic parameters of melatonin in plasma of rats before microwave radiation(n=5)

注：(1)對(duì)A作F檢驗(yàn)，P<0.05。

2.2 微波輻照對(duì)大鼠血漿Mel水平晝夜節(jié)律的影響

微波輻射后，對(duì)照組和照射組血漿Mel水平相位響應(yīng)曲線如圖1所示，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)組微波暴露后，雄性大鼠血漿Mel水平相位響應(yīng)曲線均發(fā)生了變化。對(duì)照組和照射組大鼠血漿Mel水平相位響應(yīng)曲線各個(gè)時(shí)點(diǎn)振幅A作F檢驗(yàn) ，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將照射組和對(duì)照組相位響應(yīng)曲線參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，2 ∶00 AM暴露于微波輻射的大鼠峰值時(shí)點(diǎn)對(duì)照組(18.10±1.88)ZT、照射組(8.73±1.01)ZT，與對(duì)照組比較，照射組峰值時(shí)點(diǎn)提前9.37 h，在6個(gè)時(shí)點(diǎn)中變化最大；2 ∶00 PM微波輻射照射組大鼠Mel水平相位響應(yīng)曲線峰值對(duì)照組為(15.12±0.90)ZT、照射組為(14.19±1.24)ZT，照射組與對(duì)照組相比，在6個(gè)暴露時(shí)點(diǎn)中變化最小，峰值時(shí)點(diǎn)延遲0.93 h；白天輻射暴露(2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值時(shí)點(diǎn)總差值為13.62 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值時(shí)點(diǎn)總差值為22.67 h，峰值時(shí)點(diǎn)是反映晝夜節(jié)律變化的敏感標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 ∶00 AM是大鼠血漿Mel對(duì)微波輻射最為敏感的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其影響最大；而2 ∶00 PM是大鼠血漿Mel對(duì)微波輻射最不敏感的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其影響最?。惶崾竞谝馆椛浔┞秾?duì)大鼠血漿Mel水平較白天明顯。

2.3 微波輻照對(duì)大鼠血漿T水平晝夜節(jié)律的影響

照射組與對(duì)照組在微波輻射暴露后血漿T水平相位響應(yīng)曲線如圖2所示。由圖可知，6個(gè)時(shí)點(diǎn)微波輻射后各組大鼠血漿T水平相位響應(yīng)曲線均發(fā)生了變化。對(duì)照組血漿T水平相位響應(yīng)曲線各個(gè)時(shí)點(diǎn)振幅A和照射組比較，如圖2所示，對(duì)各組振幅A作F檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將照射組和對(duì)照組相位響應(yīng)曲線參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，6 ∶00 PM暴露于微波輻射的大鼠峰值時(shí)點(diǎn)為(0.61±0.76)ZT，對(duì)照組為(12.72±0.83)ZT，照射組與對(duì)照組比較，峰值時(shí)點(diǎn)提前12.11 h，在6個(gè)時(shí)點(diǎn)中變化最大；10 ∶00 AM暴露于微波輻射的大鼠血漿T水平相位響應(yīng)曲線峰值時(shí)點(diǎn)為(9.17±0.69)ZT、對(duì)照組為(12.18±0.68)ZT，與對(duì)照組比較，照射組峰值時(shí)點(diǎn)提前3.01 h，在6個(gè)暴露時(shí)點(diǎn)中變化最?。话滋燧椛浔┞?2 ∶00 PM、6 ∶00 PM和10 ∶00 AM)峰值時(shí)點(diǎn)總差值為18.94 h，黑夜(2 ∶00 AM、6 ∶00 AM和10 ∶00 PM)峰值時(shí)點(diǎn)總差值為20.02 h。結(jié)果提示，6 ∶00 PM左右是大鼠血漿T對(duì)微波輻射最為敏感的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其影響最大；10 ∶00 AM左右是大鼠血漿T對(duì)微波輻射最不敏感的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其影響最小；提示黑夜輻射暴露對(duì)大鼠血漿T水平影響較白天明顯。

注:A為10 ∶00 AM、B為10 ∶00 PM、C為2 ∶00 AM、D為2 ∶00 PM、E為6 ∶00 AM、F為6 ∶00 PM，圖中ZT0點(diǎn)為自然時(shí)間9 ∶00 AM，橫軸灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。圖1 大鼠血漿Mel水平相位響應(yīng)曲線結(jié)果Fig.1 PRCs for plasma of rats melatonin concentrations

注：A為10 ∶00 AM、B為10 ∶00 PM、C為2 ∶00 AM、D為2 ∶00 PM、E為6 ∶00 AM、F為6 ∶00 PM，圖中ZT0點(diǎn)為自然時(shí)間9 ∶00 AM，橫軸灰色部分代表黑夜，白色部分代表白天。圖2 大鼠血漿T水平相位響應(yīng)曲線結(jié)果Fig.2 PRCs for plasma of rats testosterone concentrations

3 討論

WHO不育癥防治專題組的研究表明生殖功能紊亂是男性不育最重要的病因之一。全世界具有不同程度生育障礙的育齡夫婦中約50%是男方因素。由于短時(shí)間內(nèi)遺傳變異造成的影響是有限的，過去50年中男性生殖功能有所下降，有可能是受到了某些環(huán)境有害因素的影響[8-9]。伴隨科技的發(fā)展，各種電磁輻射暴露也越來(lái)越多，生殖器官作為電磁輻射的敏感器官，使得人們?cè)絹?lái)越重視其帶來(lái)的影響。

本實(shí)驗(yàn)選擇Mel水平作為篩選條件是由于松果體產(chǎn)生的Mel受光周期制約，體內(nèi)Mel的含量呈晝夜性節(jié)律改變，從而使生物體的功能活動(dòng)與外界的環(huán)境變化相適應(yīng)，且Mel可通過下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)生殖系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，下丘腦是Mel調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的主要部位及靶器官[2,10-11]。本實(shí)驗(yàn)中照射組在輻射后Mel和T水平各個(gè)時(shí)點(diǎn)組均升高，提示Mel的變化可能對(duì)血漿T水平有影響，這與Shou等[12]的研究結(jié)果類似，其研究顯示Mel可通過Leydig細(xì)胞的Mel受體影響睪丸的內(nèi)分泌活動(dòng)，影響血漿性激素水平。性激素對(duì)生殖系統(tǒng)功能起著關(guān)鍵作用，同時(shí)對(duì)環(huán)境適應(yīng)、維持機(jī)體平衡和神經(jīng)系統(tǒng)等也起著重要作用。雄性動(dòng)物體內(nèi)中T是最重要的性激素，T水平異常可干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響雄激素生物學(xué)作用，導(dǎo)致生殖功能紊亂，其激素改變可能是微波輻射影響雄性生殖功能的基礎(chǔ)[13]。Myung等[14-15]的研究也認(rèn)為電磁輻射能影響機(jī)體生殖內(nèi)分泌功能。本實(shí)驗(yàn)顯示不同時(shí)點(diǎn)微波暴露對(duì)血漿激素水平的影響不同，證實(shí)了電磁輻射對(duì)Mel和T的影響。2 ∶00 AM微波輻射對(duì)血漿Mel影響最大，說(shuō)明其對(duì)微波輻射敏感時(shí)間為2 ∶00 AM左右；而微波輻射對(duì)血漿T影響最大的敏感時(shí)間段為6 ∶00 PM左右。由于機(jī)體對(duì)外界環(huán)境刺激的敏感度在一天中并不穩(wěn)定，這也就解釋了不同時(shí)點(diǎn)微波輻射對(duì)激素影響不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示微波輻射在黑夜對(duì)大鼠血漿激素水平的影響較白天更為明顯。然而，細(xì)胞感受電磁輻射物理信號(hào)、電磁輻射能量在生物組織轉(zhuǎn)化及傳遞和引起敏感組織與細(xì)胞的損傷機(jī)理仍不清楚，電磁輻射影響的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)中，微波輻射在各個(gè)時(shí)點(diǎn)暴露對(duì)血漿Mel和T水平均有影響，表現(xiàn)為振幅和峰值時(shí)點(diǎn)改變、中值增高，但機(jī)體對(duì)不同時(shí)點(diǎn)微波輻射的敏感度不同，這也提示，可通過避免暴露于機(jī)體對(duì)微波輻射敏感的時(shí)間段來(lái)降低電磁輻射影響，為電磁輻射防護(hù)提供新思路和理論依據(jù)。