蔡爽，韓冰，鄭璐，湯雷，馬子華，陳雨絲，楊婷，楊勤，謝汝佳

(貴州醫(yī)科大學 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025)

肝癌是世界上第六大常見癌癥，每年約有84.1萬新病例和78.2萬人死亡[1]。肝癌惡性程度高，復發(fā)率高，容易侵襲轉移，且大多數患者確診時已處于中晚期階段，不適合手術、肝移植或局部消融等治療方法[2-3]，因此非手術治療在肝癌的治療中占有重要地位。索拉菲尼(sorafenib,SOR)是美國FDA批準用于晚期肝癌治療的分子靶向藥物[4-5]，研究表明，SOR可以通過抑制血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)的表達、從而阻斷腫瘤血管生成[6-7]；此外，SOR還具有抗絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)激酶Raf的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖和信號轉導[8]。盡管SOR在臨床肝癌的治療中取得了一定的突破和進展，但總體效果并不十分滿意。因此，如何提高SOR的臨床療效成為迫切需要解決的難題。近年來有研究報道，辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)，一種用于臨床血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的新型抗癌藥物與SOR聯(lián)合應用時可顯著增強SOR對肝癌細胞增殖的抑制作用，但其具體的作用機制還有待進一步闡明。本研究旨在觀察SAHA聯(lián)合SOR對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響，并初步探討HepG2細胞中葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、及活化轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)蛋白表達的分子機制，為臨床肝癌的治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細胞庫(KCB 200507YJ)，索拉菲尼由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肛腸外科詹瑋博士惠贈，SAHA購自英國Abcam公司，胎牛血清購自美國ScienCell公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰酶購自Biological Industry，彩虹 Marker購自上海愛必信生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒和AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司，兔抗GAPDH、兔抗GRP78、兔抗PERK、兔抗ATF4購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清，1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液，細胞密度85% 時以1 ∶2傳代。本實驗所使用細胞均處于對數生長期。

1.2.2細胞活力檢測 采用MTT法取對數生長期的HepG2細胞，以104個/孔密度接種于96孔板，放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的SOR(0.5、1、3、6、12、25、50 μmol/L)、SAHA(0.5、1、3、6、12、25、50 μmol/L)及同劑量的SAHA 聯(lián)合SOR(劑量同前)處理細胞，同時設置陰性對照組和空白對照組，每個濃度均設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL培養(yǎng)4 h，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL ，置于搖床上低速震蕩10 min 、在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔的吸光度值(OD)，計算各組細胞存活率并繪制生長曲線。存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3細胞凋亡 采用流式細胞術檢測，隨機將對數生長期的HepG2細胞分為對照(control)組、SOR組(12 μmol/L)、SAHA組(6 μmol/L)及SAHA聯(lián)合SOR組(6 μmol/L+12 μmol/L)。給藥48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化收集各組細胞，2 000 r/min離心5 min后棄上清，加入的binding buffer液500 μL懸浮細胞，再加入5 μL annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)，充分混勻，室溫避光反應15 min后用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白水平 采用Western blot法檢測，收集各組細胞，用蛋白裂解液提取細胞中的總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取40 μg總蛋白上樣，經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉90 min，加入相應 I 抗，4 ℃ 孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次后加入Ⅱ抗，室溫孵育90 min，TBST洗膜后ECL發(fā)光成像，Bio-Rad凝膠成像儀系統(tǒng)獲取圖像。用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細胞增殖的抑制作用

MTT法結果顯示,與對照組比較，不同濃度的SAHA和SOR均能明顯抑制HepG2細胞的增殖，且SAHA或SOR對HepG2的抑制作用呈明顯的劑量依賴性。與單獨的SAHA和SOR組比較，SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細胞增殖的抑制作用更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。根據MTT結果，后續(xù)實驗中選擇6 μmol/L SAHA、12 μmol/L SOR及6 μmol/L SAHA聯(lián)合12 μmol/L SOR處理HepG2細胞進行后續(xù)實驗。

注：(1)與control比較，P<0.01；(2)與SAHA組比較，P<0.01 ；(3)與SOR組比較，P<0.01。圖1 SAHA、SOR及兩藥聯(lián)合對HepG2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of SAHA,SOR and two drugs on survival rate of HepG2 cells

2.2 SAHA聯(lián)合SOR對HepG2細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測各組細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，6 μmol/L SAHA 、12 μmol/L SOR及兩藥聯(lián)合均能明顯誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡。6 μmol/L SAHA處理HepG2細胞48 h后的凋亡率為(10.85±0.86)%，12 μmol/L SOR處理HepG2細胞48 h后的凋亡率為(13.57±1.12)%，SAHA聯(lián)合SOR處理HepG2細胞48 h后的凋亡率為(23.20±1.06)%；上述3組細胞凋亡率均顯著高于對照組,其中以聯(lián)合用藥組凋亡率最高，與SOR和SAHA單藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 HepG2細胞中GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白表達

與對照組比較，SAHA和SOR單藥組可在一定程度上調HepG2細胞GRP78、p-PERK、ATF4蛋白的表達，兩藥聯(lián)合上述效應更加顯著，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而SAHA、SOR及兩藥聯(lián)合對PERK蛋白的表達無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與control組比較，P<0.01；(2)與SAHA組比較，P<0.01 ；(3)與SOR組比較，P<0.01。圖2 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對HepG2細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of SOR,SAHA and two drugs on apoptosis of HepG2 cells

注：(1)與control組比較，P<0.05 ；(2)與SAHA組比較，P<0.05 ；(3)與SOR組比較，P<0.05。圖3 SOR、SAHA及兩藥聯(lián)合對HepG2細胞中GRP78、PERK、p-PERK及ATF4蛋白表達的影響(Western blot)Fig.3 Effects of SOR,SAHA and two drugs on the expression of GRP78,PERK,p-PERK and ATF4 in HepG2 cells(Western blot)

3 討論

SOR是一種多靶點口服抗腫瘤藥物，也是一種多激酶抑制劑，因其對腎細胞癌和肝細胞癌的療效，在臨床上，已被批準用于治療晚期腎細胞癌和肝細胞癌[4-5]。SOR具有雙重的抗腫瘤作用，一方面它可通過阻斷由RAF/MEK/ERK介導的細胞信號傳導通路而直接抑制腫瘤細胞的增殖[8-9]；另一方面它還可通過抑制VEGFR和PDGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成，從而間接地抑制腫瘤細胞的生長[6-7]。雖然SOR為臨床肝癌的治療打開了一扇希望之窗，但總體效果并不十分令人滿意，因此，如何提高SOR的臨床療效成為迫切需要解決的難題。近年來Yuan H[10]的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA與SOR聯(lián)合應用時可顯著抑制體外培養(yǎng)肝癌細胞的增殖。本次研究結果也證實了SAHA與SOR聯(lián)合應用能夠顯著抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，表明兩藥具有協(xié)同效應，因此，兩藥聯(lián)合可能為臨床上治療肝癌提供更優(yōu)的治療效果。

SAHA是一種廣譜組蛋白去乙?；敢种苿醒芯勘砻?，它可通過抑制細胞周期進程、誘導細胞凋亡和分化從而抑制肝癌細胞的生長[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SAHA可以激活內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路從而誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡[12]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞中重要的細胞器，幾乎所有分泌型蛋白(包括膜結合蛋白)都在ER中產生。ER不僅參與了蛋白質的合成和折疊，還參與了鈣平衡的調節(jié)以及膽固醇和類固醇等脂質的生物合成，以此來調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)[13]。而當這些過程受到多種生理性或病理性因素的干擾時，會導致未折疊或錯誤折疊蛋白質在ER中積累，最終導致ER穩(wěn)態(tài)失去平衡，引發(fā)ERS。在ERS條件下，細胞能夠激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)，通過一系列信號轉導途徑以減輕或終止ERS，從而恢復細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。然而，當刺激因素持續(xù)時間過長或強度過大時，UPR也可激活細胞凋亡通路導致細胞死亡[14-15]。ERS介導的細胞凋亡在很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。因此，通過激活ERS凋亡通路促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，有望成為腫瘤治療的新靶點[16-17]。

當前的研究報道可知，UPR信號轉導過程主要由以下3種內質網跨膜效應蛋白所啟動：活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和PERK[14]。正常情況下ATF6、IRE1和PERK與內質網分子伴侶GRP78緊密結合，從而處于無活性狀態(tài)。發(fā)生ERS時，由于內質網腔中積累的未折疊或錯誤折疊蛋白與GRP78競爭結合，導致GRP78與3種跨膜蛋白發(fā)生解離。解離后的PERK、IRE1和ATF6通過各自的途徑被激活，例如，與GRP78解離后的PERK可通過自身二聚化和磷酸化被激活，并進一步促進其下游的ATF4及CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達，從而誘導細胞凋亡的發(fā)生[18]。在本次研究中，流式細胞術檢測結果表明兩藥聯(lián)合能顯著促進HepG2細胞凋亡，說明兩藥聯(lián)合不僅能抑制肝癌細胞的增殖，同時還促進了肝癌細胞的凋亡。進一步通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SAHA組和SOR組的GRP78、p-PERK和ATF4表達均較對照組顯著上調，說明SAHA、SOR均可通過激活ERS凋亡信號通路促進肝癌細胞凋亡；而SAHA聯(lián)合SOR能進一步促進上述蛋白的表達，提示ERS凋亡通路可能是SAHA增強SOR促進肝癌細胞凋亡的靶點之一，其機制可能是經SAHA和SOR聯(lián)合處理肝癌細胞后，通過阻斷蛋白質從內質網到高爾基體的運輸，誘導了高水平的ERS，從而激活了PERK-ATF4信號通路，啟動細胞凋亡信號。

綜上所述，SAHA和SOR能夠協(xié)同增強對肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用，且能顯著誘導肝癌細胞的凋亡，其協(xié)同作用可能與激活ERS凋亡通路有關。