羅嘉亮，李 凡，郝瑞杰，李六林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 晉中 030801）

杜梨Pyrus betulaefoliaBunge適應(yīng)性強(qiáng)，因其與梨樹嫁接親和力強(qiáng)，已成為我國(guó)北方梨產(chǎn)區(qū)梨樹的主要砧木。目前杜梨繁育以種子繁殖為主，但由于后代變異多，易造成嫁接品種樹勢(shì)、抗逆性等方面的差異較大，給梨園的統(tǒng)一管理帶來(lái)了難度。組織培養(yǎng)是快速獲得基因型一致的梨砧木繁育關(guān)鍵方法之一[1]。而提高組培砧木的移栽成活率，獲得健壯根系是杜梨組培工作中的重要一步，因此，展開組培杜梨根系的相關(guān)研究尤其重要。

生長(zhǎng)素是植物不定根誘導(dǎo)與發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵影響因素[2]。已有研究結(jié)果表明，吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）等對(duì)根系發(fā)育都有調(diào)節(jié)作用[3]，但生長(zhǎng)素的種類和濃度對(duì)不同品種樹種的作用效果存在較大差異。周新華等[4]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多花黃精生根的能力，NAA強(qiáng)于IBA和IAA，且在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，其誘導(dǎo)能力也不斷加強(qiáng)。楊光等[5]在對(duì)2種無(wú)性系柚木的扦插試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IAA處理的生根誘導(dǎo)效果最佳，其生根率、根生物量、葉面積和株高均高（大）于IBA和NAA處理的。卜祥潘等[6]則認(rèn)為，IBA更適用于火焰衛(wèi)矛不定芽的生根誘導(dǎo)。

以生長(zhǎng)素誘導(dǎo)植物體不定根的發(fā)生，與氧化酶活性的變化密切相關(guān)。姜宗慶等人[7]的研究結(jié)果表明，過(guò)氧化物酶（POD）活性在生根前期快速上升則有利于插穗基部愈傷組織的形成，而超氧化物歧化酶（SOD）活性在整個(gè)生根過(guò)程中均處于較高狀態(tài)，這對(duì)植株能起到保護(hù)作用。扈紅軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在以IBA誘導(dǎo)桑樹不定根的形成過(guò)程中，多酚氧化酶（PPO）活性在誘導(dǎo)期和表達(dá)期均升高，而吲哚乙酸氧化酶（IAAO）僅在表達(dá)期具有較高的活性因而更利于不定根的形成。目前，有關(guān)不同生長(zhǎng)素對(duì)杜梨生根及根系形成過(guò)程中酶活性變化情況的研究還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。因此，本研究以杜梨不定芽為試驗(yàn)材料，通過(guò)測(cè)定相關(guān)生根指標(biāo)篩選外源生長(zhǎng)素的種類，并通過(guò)觀察生根過(guò)程中莖段基部組織內(nèi)外形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以明確不定根發(fā)生的類型與部位，進(jìn)一步了解該生長(zhǎng)素誘導(dǎo)不定根形成過(guò)程中酶活性的變化規(guī)律，以期為杜梨等難生根植物的生根研究提供理論指導(dǎo)和技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樹種為杜梨，于2017年5月采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所梨資源圃，并在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)梨原種保存與擴(kuò)繁基地進(jìn)行了10代的連續(xù)繼代培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取生長(zhǎng)一致、健壯的杜梨不定芽，將其接種于1/2MS+生長(zhǎng)素+6 g·L-1的瓊脂+20 g·L-1的蔗糖培養(yǎng)基上，分別選用IAA、IBA、NAA這3種外源生長(zhǎng)素，每種生長(zhǎng)素設(shè)4個(gè)濃度（0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）處理，以清水為對(duì)照（CK），每個(gè)處理接種30株，重復(fù)3次。在光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。培養(yǎng)條件：溫度控制在25 ℃左右，光照16 h、黑暗8 h，光強(qiáng)為 2 000～3 000 lx。

1.3 生根指標(biāo)的測(cè)定

杜梨不定芽生根培養(yǎng)30 d后測(cè)定各處理的生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)和生根指數(shù)、愈傷組織級(jí)數(shù)（參考劉永富的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行分級(jí)），其計(jì)算公式分別如下：

生根率(%)=生根苗數(shù)/接種時(shí)總苗數(shù)×100%；

平均根數(shù)(條·株-1)=生根總數(shù)/接種時(shí)總苗數(shù)；

平均根長(zhǎng)(cm)=生根總根長(zhǎng)(cm)/生根總條數(shù)；

生根指數(shù)=生根率×平均生根數(shù)×平均根長(zhǎng)。

在0.5 mg·L-1的IBA處理組開始進(jìn)行生根培養(yǎng)后，每隔4 d隨機(jī)取樣，觀察莖段基部形態(tài)，制作石蠟切片，并將部分莖段基部剪碎后充分混勻，稱取樣品0.5 g，置于液氮中速凍，保存于-80 ℃的冰箱中以備后續(xù)相關(guān)酶活性測(cè)定之用。

IAAO、PPO、SOD、POD活性的測(cè)定，分別參照高俊鳳[10]、盧緒娟等[11]、王學(xué)奎[12]、李合生[13]的方法（略作修改）進(jìn)行。

使用Nikon SMZ18正置體視顯微鏡拍照，記錄不同時(shí)期莖段基部外部形態(tài)變化情況，參照侯福林[14]的方法制作石蠟切片，使用Nikon NI-U正置顯微鏡觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，使用SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源生長(zhǎng)素對(duì)杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響

外源生長(zhǎng)素對(duì)杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響情況見(jiàn)表1，杜梨不定芽生根誘導(dǎo)愈傷組織的觀察結(jié)果如圖1所示。由表1可知，杜梨不定芽不定根經(jīng)不同濃度的NAA、IBA和IAA誘導(dǎo)，其生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)、生根指數(shù)和愈傷組織級(jí)數(shù)均存在顯著差異。在同一種生長(zhǎng)素處理下，濃度分別為0.1和2.0 mg·L-1的處理組的各項(xiàng)生根指標(biāo)均顯著低于其余2個(gè)濃度處理組；對(duì)照組不定芽的生根率為0。同在NAA和IBA的處理下，質(zhì)量濃度分別為0.5和1.0 mg·L-1的生根率無(wú)顯著性差異，但都顯著高于質(zhì)量濃度分別為0.1和2.0 mg·L-1的處理組。在1.0 mg·L-1的NAA 處理下，其生根率為45.23%，低于0.5 mg·L-1的NAA處理的47.73%，除此之外，其平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)、生根指數(shù)分別為2.47條·株-1、2.4 cm、2.66，均高于其他處理，但其愈傷組織的級(jí)數(shù)為3～4級(jí)，其愈傷組織松軟易脫落，故不利于后期移栽成活。在不同濃度的IBA處理下，濃度分別為0.5和 1.0 mg·L-1的處理組的生根率分別高達(dá)66.70%和67.20%，其平均生根數(shù)皆為2.37條·株-1，其平均根長(zhǎng)分別為1.83和1.80 cm，其生根指數(shù)分別為2.88和2.86，其愈傷組織級(jí)數(shù)分別為1和2級(jí)。當(dāng)IAA的濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg·L-1時(shí)，其生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)和生根指數(shù)的差異均不顯著，其愈傷組織級(jí)數(shù)分別為1、1～2和3級(jí)。

表1 外源生長(zhǎng)素對(duì)杜梨不定芽不定根發(fā)生的影響?Table 1 Effects of exogenous auxins on adventitious root formation in P.betulifolia adventitious buds

2.2 杜梨不定芽在生根過(guò)程中的外部形態(tài)與組織學(xué)觀察結(jié)果

在IBA誘導(dǎo)杜梨不定芽生根的過(guò)程中其外部形態(tài)與組織學(xué)的觀察結(jié)果如圖2所示。從圖2a和e中可以看出，在不定芽生根誘導(dǎo)0 d時(shí)，未經(jīng)誘導(dǎo)的不定芽基部顏色為綠色，觀察其組織學(xué)切片可知，其內(nèi)部由外到內(nèi)可分為表皮、皮層、韌皮部、維管束形成層和髓，莖段基部未發(fā)現(xiàn)有潛伏根原基，不定根原基屬于誘生根原基類型。經(jīng)外源 0.5 mg·L-1的IBA誘導(dǎo)4 d后，莖基部顏色變紅，局部膨大，圖2b和f顯示，形成層與韌皮部的細(xì)胞分裂旺盛，開始誘導(dǎo)球狀根原基細(xì)胞。當(dāng)不定芽生根誘導(dǎo)8 d時(shí)，其基部出現(xiàn)愈傷組織，圖2c和g顯示，“個(gè)”狀根原基基本形成，并向外生長(zhǎng)。當(dāng)不定芽生根誘導(dǎo)12 d后，圖2d和h顯示，其不定根突破表皮或愈傷組織而露出莖外。

圖1 杜梨不定芽生根誘導(dǎo)愈傷組織的觀察結(jié)果Fig.1 Observation results of induced calli during adventitious bud rooting of P.betulifolia.

圖2 以IBA誘導(dǎo)杜梨不定芽生根過(guò)程中其外部形態(tài)與組織學(xué)的觀察結(jié)果Fig.2 External morphology and histological observation results of induced rooting process from P.betulifolia adventitious buds by IBA

2.3 外源生長(zhǎng)素對(duì)杜梨不定芽生根過(guò)程中相關(guān)酶活性的影響

2.3.1 PPO活性的變化

杜梨不定芽生根過(guò)程中相關(guān)酶活性的變化情況如圖3所示。由圖3可知，杜梨不定芽的PPO活性隨IBA生根劑誘導(dǎo)時(shí)間的推移呈現(xiàn)上升→下降→上升的變化趨勢(shì)。處理組不定芽的PPO活性在生根誘導(dǎo)開始即迅速上升，誘導(dǎo)4 d后達(dá)到峰值，在誘導(dǎo)4～12 d中持續(xù)下降直至最低值，隨后緩慢上升；對(duì)照組不定芽的PPO活性在生根誘導(dǎo)開始便緩慢上升，誘導(dǎo)8 d后達(dá)到峰值，在隨后的8～16 d中持續(xù)降低?？偟膩?lái)看，添加外源IBA有利于提高生根誘導(dǎo)4 d時(shí)不定芽的PPO活性，誘導(dǎo)后期（8～16 d）PPO的活性，處理組均低于對(duì)照組。

2.3.2 IAAO活性的變化

處理組不定芽的IAAO活性隨著不定根誘導(dǎo)時(shí)間的推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)。在杜梨生根過(guò)程中，不定芽的IAAO活性，處理組始終低于同期對(duì)照組。處理組不定芽的IAAO活性，在誘導(dǎo)0～8 d時(shí)迅速下降，尤其在誘導(dǎo)0～4 d時(shí)其下降幅度最大，在隨后的8～12 d中持續(xù)上升，并在12～16 d時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。對(duì)照組不定芽的IAAO活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，在誘導(dǎo)8 d時(shí)達(dá)到峰值。

2.3.3 POD活性的變化

杜梨不定芽生根過(guò)程中，處理組不定芽的POD活性隨誘導(dǎo)天數(shù)的增加而呈現(xiàn)出上升→下 降→上升→下降的變化趨勢(shì)，在誘導(dǎo)4和12 d時(shí)分別出現(xiàn)第1個(gè)和第2個(gè)峰值。而對(duì)照組不定芽的POD活性只在生根誘導(dǎo)8 d時(shí)出現(xiàn)了1個(gè)峰值。與對(duì)照組的相比，IBA處理組不定芽的POD活性在生根誘導(dǎo)前期（0～8 d）有所提高。

圖3 杜梨不定芽生根過(guò)程中相關(guān)酶活性的變化情況Fig.3 Changes of related enzyme activities in rooting process of P.betulifolia adventitious buds

2.3.4 SOD活性的變化

處理組不定芽的SOD活性隨著生根誘導(dǎo)天數(shù)的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在生根誘導(dǎo)后迅速上升，誘導(dǎo)4 d后即達(dá)到峰值，隨后緩慢下降。對(duì)照組不定芽的SOD活性則呈現(xiàn)出下降→上升→下降的變化趨勢(shì)，在誘導(dǎo)0～4 d內(nèi)緩慢下降，隨后迅速上升，在誘導(dǎo)8 d時(shí)達(dá)到峰值，誘導(dǎo)8～16 d內(nèi)持續(xù)下降。

3 結(jié)論與討論

外源生長(zhǎng)素處理可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源生長(zhǎng)素水平來(lái)調(diào)節(jié)植物體細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)速度，從而促進(jìn)不定根原基的形成[15]。在組培快繁中，多采用NAA、IBA和IAA進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。在火焰衛(wèi)矛不定芽生根培養(yǎng)基中只添加IBA時(shí)，其生根數(shù)和平均根長(zhǎng)均達(dá)到最大值[6]。本研究采用3種生長(zhǎng)素誘導(dǎo)杜梨不定芽生根的試驗(yàn)結(jié)果表明，IBA的生根誘導(dǎo)效果最佳，這與有關(guān)研究者對(duì)火焰衛(wèi)矛、巴西梨品種Pyrus betulaefolia[16]的研究結(jié)果均類似。楊超臣等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在生根培養(yǎng)基中添加0.1或0.5 mg·L-1的NAA時(shí)，植株基部產(chǎn)生大量的愈傷組織。劉永富[9]研究發(fā)現(xiàn)，NAA可使植株莖基部產(chǎn)生較大的愈傷組織，但不利于其移栽成活。以相同濃度的NAA與IBA處理的生根指數(shù)無(wú)顯著性差異，但以NAA誘導(dǎo)的生根率較低，愈傷組織較大，阻礙了不定根的生長(zhǎng)，這與上述的研究結(jié)果也都一致；但胡勐鴻[18]認(rèn)為，NAA可抑制愈傷組織的形成，低濃度的NAA可促進(jìn)歐洲云杉的生根。前人的研究結(jié)果都表明，IAA被基部吸收后性質(zhì)不穩(wěn)定，釋放較多游離的IAA，易被氧化酶氧化，其作用持續(xù)的時(shí)間短[19]，這可能是IAA在上述3種生長(zhǎng)素處理中誘導(dǎo)效果最差的主要原因。研究中發(fā)現(xiàn)，不同植物對(duì)IBA誘導(dǎo)生根所需最適濃度不盡相同[20]，本研究結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的IBA更利于杜梨不定根的誘導(dǎo)。不同激素配比可能更利于植株生根，后續(xù)研究應(yīng)使用IBA與NAA或IAA進(jìn)行不同濃度的配比試驗(yàn)，以全面提高杜梨不定芽的生根率。

根原基可劃分為潛伏根原基和誘導(dǎo)根原基兩種，誘導(dǎo)根原基的植物多為難生根樹種，需要一定的外源激素誘導(dǎo)才能形成不定根[21]。核桃屬于難生根植物，當(dāng)其受到激素誘導(dǎo)后，插穗形成層和韌皮部的交叉區(qū)域的細(xì)胞分裂旺盛，逐漸形成不定根原基[22]。馬俊紅等[23]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果生根類型屬于誘生原基，其不定根形成過(guò)程可分為3個(gè)時(shí)期。本研究切片觀察杜梨莖基部后未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，因此杜梨不定根發(fā)生屬于誘導(dǎo)根原基，據(jù)此可以解釋清水處理下未能誘導(dǎo)出不定根的原因。杜梨不定根起源于韌皮部與形成層的交界處，其發(fā)育過(guò)程可分為根原基的誘導(dǎo)、根原基的形成和不定根的伸長(zhǎng)，這與劉昊[22]和馬俊紅等[23]的研究結(jié)果均類似。

酚氧化酶（PPO）是一種含銅的酚類氧化酶，將酚類物質(zhì)和IAA的混合液在PPO作用下，酚類物質(zhì)完全消失，IAA含量降低，在高效液相色譜上檢查出3個(gè)新物質(zhì)色譜峰[24]。這類新物質(zhì)為“IAA-酚酸”化合物，是一種有助于促進(jìn)不定根發(fā)生的輔助因子，對(duì)植物生根具有重要調(diào)節(jié)作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在生根誘導(dǎo)前期，IBA處理有利于不定芽PPO活性持續(xù)快速上升，合成更多的生根輔助因子，從而促進(jìn)不定根原基的誘導(dǎo)。本研究與葡萄[26]扦插生根同樣發(fā)現(xiàn)，在生根后期PPO活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，推測(cè)隨著時(shí)間的推進(jìn)，不定芽體內(nèi)酚類物質(zhì)含量降低，PPO活性隨之降低。

吲哚乙酸氧化酶（IAAO）是一種能夠降解IAA的氧化酶，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA的含量，從而影響不定根的啟動(dòng)與形成[21]。本研究結(jié)果表明，杜梨不定芽生根過(guò)程中IAAO活性在誘導(dǎo)0～8 d時(shí)下降至較低水平，有利于提高植物內(nèi)源IAA濃度，從而促進(jìn)不定根的誘導(dǎo)與形成，而在生根后期（誘導(dǎo)8～16 d），IAAO活性上升有利于降低內(nèi)源IAA含量，從而促進(jìn)不定根的表達(dá)與伸長(zhǎng)，這與牡丹[27]和櫻桃矮化砧[28]的試驗(yàn)結(jié)果一致。但在歐榛[8]和國(guó)槐[29]的扦插生根試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在生根誘導(dǎo)前期，IAAO活性升高，降低內(nèi)源IAA濃度，有利于不定根的誘導(dǎo)，而在生根誘導(dǎo)后期，IAAO活性降低，提高內(nèi)源IAA的含量則有利于不定根的生長(zhǎng)。這可能是由不同植物體之間生根所需生長(zhǎng)素含量差異造成的。

前人研究發(fā)現(xiàn)，在桉樹Eucalyptus[30]和沙生檉柳[31]生根過(guò)程中POD活性會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)峰值，本試驗(yàn)研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在生根誘導(dǎo)過(guò)程中，POD分別在誘導(dǎo)4和12 d時(shí)出現(xiàn)峰值，且其活性均顯著高于對(duì)照組，這可能與不定根原基誘導(dǎo)和不定根伸長(zhǎng)均有關(guān)。但也有研究者發(fā)現(xiàn)，在桑樹[32]扦插生根過(guò)程中，POD活性只出現(xiàn)了單峰變化趨勢(shì)。杜梨組織中富含多酚等次生代謝物質(zhì)[33]，在酚類物質(zhì)存在的條件下，POD參與生長(zhǎng)素的代謝和細(xì)胞壁的木質(zhì)化[34]，這可能是IBA處理提高POD活性從而促進(jìn)生根的原因。

SOD與植物抗逆密切相關(guān)，反映了植物抗氧化與自身修復(fù)能力。有關(guān)研究結(jié)果表明，高活性SOD可以減少自由基對(duì)植株的傷害[35]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源IBA處理顯著提升生根誘導(dǎo)前期（誘導(dǎo)4 d）SOD活性，這可能是提高不定根誘導(dǎo)的成活率關(guān)鍵因素。SOD活性在整個(gè)生根誘導(dǎo)過(guò)程中呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。在生根誘導(dǎo)0～4 d時(shí)，不定芽脫離母株，植株處于逆境脅迫中，SOD活性迅速上升，不定芽基部得以保護(hù)，有利于細(xì)胞分裂，不定根原基的誘導(dǎo)；而在誘導(dǎo)8 d時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)并對(duì)莖基部起到保護(hù)作用；誘導(dǎo)12 d后，不定根開始向表皮外伸長(zhǎng)，不定芽長(zhǎng)成完整植株，其抗逆能力增強(qiáng)。因此，誘導(dǎo)8～16 d時(shí)，SOD活性處于下降水平，這與柃木[36]和薄殼山核桃[7]的研究結(jié)果一致。上述4種氧化酶主要通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平，從而影響不定根的發(fā)生，后續(xù)研究應(yīng)測(cè)定內(nèi)源激素含量，分析酶如何調(diào)節(jié)激素來(lái)影響生根，并結(jié)合不定根發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，深入揭示杜梨不定根發(fā)生的分子機(jī)理。

綜上所述，外源IBA對(duì)杜梨不定芽不定根發(fā)生效果最好，當(dāng)其濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，各項(xiàng)生根指標(biāo)均較理想，且愈傷組織較小，有利于后期的移栽成活。不定根發(fā)生屬于誘生根原基，起源于韌皮部和維管束形成層的交界處，其發(fā)生過(guò)程包含三個(gè)時(shí)期。IBA處理改變了不定根誘導(dǎo)過(guò)程中PPO、IAAO、POD、SOD的活性，其共同作用影響著不定根的誘導(dǎo)與生長(zhǎng)。