余 行 潘洪彬 程燕東 杜津京 周全江 字玲錦 雷清芝 曹振輝*

（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201；2.云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明650201）

飼料富含蛋白質、淀粉、維生素等營養(yǎng)成分，且結 構疏松、吸濕性強，因此在一定溫度、濕度條件下，微生物易繁殖而發(fā)生腐敗或霉變[1]。霉變飼料因霉菌大量繁殖產生霉菌毒素（Mycotoxin），對飼料安全構成極大的威脅[2]，霉菌毒素可通過食物鏈蓄積并威脅人類健康。Park 等[3]研究表明，霉菌毒素能夠通過破壞腸道屏障、增加腸道通透性、誘導腸上皮細胞的炎癥反應，嚴重損害腸道健康，影響動物生產性能的發(fā)揮。據(jù)聯(lián)合國糧農組織（FAO）估計，全世界每年有數(shù)十億噸糧食、飼料等農產品受到霉菌污染[4]，給飼料工業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前化學防霉劑主要應用于飼料生產，主要分為三類:有機酸防霉劑、有機酸鹽防霉劑和復合防霉劑。其中有機酸防霉劑主要包括苯甲酸、丙酸、乙酸、富馬酸等，具有防霉效果好的特點，但腐蝕性較大[5]。飼料添加化學防霉劑會影響適口性，且因藥物殘留、價格昂貴而不被廣泛采用，與當今及未來對綠色食品的消費需求不符。因此，研發(fā)安全可靠、綠色環(huán)保、功能豐富的飼料防霉劑具有良好的應用前景。

植物精油是從芳香類植物或藥用植物的根、莖、葉、花或果實中提取的具有揮發(fā)性的油狀液體，又稱揮發(fā)油，主要成分含有萜烯類及其衍化物、芳香族化合物和含氮、含硫化物等[6]。大部分植物精油都有殺菌、抑菌[7]、防霉、驅蟲以及抗氧化[8]等功能，被應用于食品添加劑、病害防治、殺菌制劑、美容化妝、養(yǎng)生保健等領域。植物精油在動物生產中的相關研究表明，植物精油對豬、雞、牛等動物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善動物腸道健康、增強機體免疫力、提高生產性能等作用[9-10]，但對飼料防霉效果鮮見報道。

本試驗選取了三種植物精油并進行復配，研究其對腸道主要致病菌和霉菌的抑制作用以及在顆粒飼料中的防霉效果，以期為減少常規(guī)獸用抗菌藥物使用及飼料防霉劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物精油與顆粒飼料

山蒼子精油(Litsea cubeba extraction oil, LCEO)、肉桂精油(Cassia oil, CO)、生姜精油(Ginger essential oil, GEO)，購自吉安市某天然植物有限公司。

肉用仔雞全價配合顆粒飼料，購自昆明某飼料有限公司。日糧組成為:玉米、豆粕、麩皮、石粉、多維、鈣磷、氨基酸、微量元素等。日糧營養(yǎng)水平為:粗蛋白≥21%、粗灰分≤7%、粗纖維≤5%、鈣0.8%～1.3%、總磷≥0.6%、氯化鈉0.3%～0.8%、水分≤13.8%、蛋氨酸≥0.45%。

1.1.2 主要試劑與儀器設備

試劑:無水硫酸鈉、瓊脂、蔗糖、無水乙醇、胰蛋白胨等，均由云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室益生菌資源挖掘與利用課題組提供。

培養(yǎng)基:PDA 液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然）；PDA瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值自然)；LB 肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 ml、pH 值7.2）；LB 固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 ml、pH值7.2）。

儀器設備:多段可編程培養(yǎng)箱（PGX-2688，寧波東南儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（CS101-2EB，重慶萬達儀器有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DPX-9162，上海?，攲嶒瀮x器設備有限公司）。

1.1.3 菌株

福氏志賀氏菌[Shigella flexneri CMCC(B) 51592]，購自廣東環(huán)凱生物技術有限司；大腸桿菌（Escherichia coli）K88、大腸桿菌（Escherichia coli）ETEC10、鼠傷寒沙門氏菌[Salmonella typhimurium CMCC(B) 50115]，由云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，益生菌資源挖掘與利用課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物精油復配

試驗前采用水蒸氣蒸餾法進行植物精油提純。將提純后的植物精油4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min后去除無水硫酸鈉，取上清液，再用0.22 μm 的微孔無菌濾膜過濾到棕色瓶，-20 ℃冰箱保存待用。將離心后的三種植物精油按體積比1∶1的比例復配成精油1（山蒼子精油+生姜精油）、精油2（山蒼子精油+肉桂精油）、精油3（生姜精油+肉桂精油），按1∶1∶1比例復配成精油4（山蒼子精油+生姜精油+肉桂精油）。

1.2.2 腸道主要致病菌抑制試驗

采用瓊脂打孔擴散法[11]，檢測不同精油及其組合對4種腸道主要致病菌生長繁殖的抑制作用。4種菌株37 ℃過夜培養(yǎng)后，吸取20 μl 菌液與20 ml 溫度為50 ℃的LB固體培養(yǎng)基劇烈混合后傾注平板。無菌條件下用4個內徑為8 mm牛津杯打孔，然后在其中3個孔中加10 μl 同種精油作為平行試驗組，在第4 個孔中加10 μl無菌水作為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 霉菌抑制試驗

霉菌分離:將自然霉變的20 g 飼料樣品加入到10 ml滅菌生理鹽水中，振蕩得孢子懸浮液，吸取1 ml加入PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d。

采用濾紙片擴散法[12]，檢測精油對霉菌生長的抑制作用。吸取500 μl、28 ℃過夜培養(yǎng)的霉菌懸液，加入10 ml 溫度為50 ℃的PDA 瓊脂培養(yǎng)基中迅速混勻后傾注到已用10 ml、2%的瓊脂鋪底的平板中，待培養(yǎng)基液凝固后，將精油浸透的圓形濾紙片放在含菌培養(yǎng)基中央，每組做3 個重復，用無菌水設置一個空白對照組，放入28 ℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，待出現(xiàn)抑菌圈后，每天定時測量3 組抑菌圈直徑，直至其大小不再變化為止。

1.2.4 飼料破壞性存放試驗

分別稱取肉用仔雞顆粒飼料1 kg 置于無菌托盤中，加入1 ml 精油，充分攪拌混勻。參照杜莉等[13]的方法進行破壞性存放試驗來預測飼料保存期，即將飼料樣品保存在較高的溫度（25～30 ℃）和濕度（75%～78%）環(huán)境中，將飼料輕度霉變的時間乘以6來預測飼料在常規(guī)儲存條件下的保存期。具體方法為:在1 L的PVC塑料杯子中部放置一個盛有45 ml水的小塑料杯子，將100 g飼料樣品均勻放置在大杯子中，飼料高度為小杯子高度的一半，然后將大杯子密封，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時觀察菌落生長情況并記錄。根據(jù)霉菌菌落生長情況來判定飼料發(fā)霉等級，共分為沒有霉變(表面無霉菌生長)、輕度霉變(表面邊緣有少量霉絲生長)、中度霉變(表面有少量散在霉菌)、重度霉變(表面基本長滿霉菌)、完全霉變(表面霉菌生長茂密)5個等級[14]。根據(jù)輕度霉變時間，預測保存期。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進行方差分析，均值比較采用Duncan's 法。結果用“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 植物精油腸道主要致病菌的抑制作用

單一植物精油對主要腸道致病菌的抑制作用如表1所示，與對照組相比，三種單一植物精油均對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌ETEC10 有抑制作用。肉桂精油對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油（P＜0.05），生姜精油對大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于肉桂精油和山蒼子精油（P＜0.05），肉桂精油對大腸桿菌K88的抑制作用顯著高于山蒼子精油（P＜0.05）。

表1 單一植物精油對腸道致病菌抑菌圈直徑的影響（mm）

復配植物精油對主要腸道致病菌的抑制作用如表2 所示，與對照組相比，四種復配精油對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌ETEC10均有抑制作用。精油1、3、4組對鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌K88 的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2 組（P＜0.05）；精油1 組對福氏志賀氏菌的抑制作用顯著高于精油2、3、4組（P＜0.05），精油3、4 組對福氏志賀氏菌的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2 組（P＜0.05）；精油4 組對大腸桿菌ETEC10的抑制作用顯著高于精油1、2、3組（P＜0.05），精油1 組和精油3 組對大腸桿菌ETEC10 的抑制作用差異不顯著，但均顯著高于精油2組（P＜0.05）。

表2 復配植物精油對腸道致病菌抑菌圈直徑的影響（mm）

2.2 植物精油對霉菌的抑制作用

單一植物精油對霉菌的抑制作用如表3所示，與對照組相比，三種單一植物精油均對霉菌有抑制作用。肉桂精油對霉菌的抑制作用顯著高于山蒼子精油和生姜精油（P＜0.05），山蒼子精油和生姜精油對霉菌的抑制作用差異不顯著。

表3 單一植物精油對霉菌抑菌圈直徑的影響（cm）

表4 復配植物精油對霉菌抑菌圈直徑的影響（cm）

復配植物精油對霉菌的抑制作用如表4所示，與對照組相比，四種復配植物精油均對霉菌有抑制作用。四種復配植物精油對霉菌的抑菌圈大小順序為:精油2組＞精油4組＞精油1組＞精油3組。

2.3 破壞性存放試驗中植物精油對飼料霉變的抑制作用

破壞性存放試驗結果如表5所示，在密閉容器中且保持較高的溫度和濕度的條件下，空白對照組在第9 d 發(fā)生霉變，添加山蒼子精油、生姜精油的飼料第10 d發(fā)生霉變，添加精油1、3的飼料在第11 d 發(fā)生霉變，添加肉桂精油的飼料在第12 d 發(fā)生霉變，添加精油2、4的飼料在第13 d發(fā)生霉變。因此，添加精油2、4 可使飼料預測保質期比空白對照組多24 d，比肉桂精油多6 d，比精油1、3多12 d，比精山蒼子精油、生姜精油多18 d。

表5 破壞性存放試驗飼料霉變時間及預測保質期

3 討論

3.1 植物精油對腸道主要致病菌的抑制作用

大腸桿菌、福氏志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌是常見的動物腸道致病菌，能引起腸道疾病，影響動物健康，目前多使用抗生素防治。但抗生素的使用導致動物腸道菌群紊亂，耐藥菌株產生，影響畜產品安全。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的精油超過3 000種，其中具有抗菌活性的有1 340 多種，約有300 余種已經(jīng)被開發(fā)利用[15]。山蒼子又稱山雞椒、木姜子、山姜子，樟木科姜子屬，其果實、根、葉、花等部位均可用于提取精油，山蒼子精油主要是從果實中提取[16]。山蒼子精油具有抗氧化、抗菌和抗炎作用[17]。Nguyen 等[18]研究山蒼子精油對病原菌抗菌活性的結果表明，山蒼子精油有較強的殺菌作用，通過改變細胞形態(tài)，破壞細胞膜完整性、通透性，改變類核形態(tài)抑制大腸桿菌生長。She 等[19]研究表明從7 月份山蒼子中提取的精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌均有抑制活性。本研究中，山蒼子精油對大腸桿菌ETEC10 的抑菌效果與肉桂精油和生姜精油相當（P＞0.05），對鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制效果與生姜精油抑菌效果相當（P＞0.05）。肉桂也稱中國肉桂，是樟科植物樟屬肉桂的干燥樹皮，含豐富的揮發(fā)油[20]。Clemente 等[21]對芥菜和肉桂精油聯(lián)合抑菌研究，發(fā)現(xiàn)兩種精油都能穿過細菌細胞膜，通過作用于細胞靶點發(fā)揮殺菌作用。Amin 等[22]采用圓盤擴散法研究不同精油對沙門氏菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)肉桂精油和百里香精油抑菌活性最高，抑菌直徑為22.5 mm和38.5 mm，這與本試驗中肉桂精油對沙門氏菌抑制效果顯著(P＜0.05)的結果具有相同之處。生姜是姜屬植物的新鮮根莖，有百辣辛等名[23]。生姜精油是從生姜根莖中提取，呈淺黃或橘黃色，透明且可流動的揮發(fā)性成分，具有特殊的香味[24]。Hossain 等[25]研究生姜精油對比目魚致病菌體外抗菌作用，發(fā)現(xiàn)生姜精油對從比目魚中分離的Edwardsiella tarda、Photobacterium damselae等5株革蘭氏陰性菌和Lactococcus garvieae、Streptococcus iniae、Streptococcus parauberis 等9 株革蘭氏陽性菌均有抑制作用。Kavas 等[26]研究表明添加1.5%生姜精油可以改善食用包衣的抗菌效果，能減少貯藏過程樣品中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌數(shù)量。趙露露等[27]研究10 種具有較強抑菌作用的植物提取物及其復配物對雞源致病菌（雞大腸桿菌和雞沙門氏菌）的抑制作用，結果表明肉桂精油、苦參堿、綠原酸對雞源致病菌有抑制作用，兩兩復配或三種植物提取物復配后對大腸桿菌的抑制作用并未優(yōu)于單一肉桂精油，本研究中由肉桂精油和山蒼子精油復配的精油2 組對鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌ETEC10 和大腸桿菌你K88 的抑制效果不如單一的肉桂精油和山蒼子精油，其原因可能是肉桂精油與山蒼子精油對以上常見腸道致病菌的抑菌機制相同，兩者復配沒有發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

3.2 植物精油對霉菌的抑制作用，以及對顆粒飼料保質期的影響

飼料發(fā)生腐敗或霉變是由微生物大量繁殖引起，霉菌是這類微生物的主體。霉菌毒素是指霉菌在其污染的谷物或飼料中所產生的一類有毒的次級代謝產物，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)的發(fā)展造成嚴重影響[28]，主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬毒素等。黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉等產毒真菌產生的次級代謝物，包括B1、B2、M1、M2等20種類型，黃曲霉毒素B1毒性最強，有致癌、致畸和致突變等作用，對人和畜禽健康危害極大[29]。玉米赤霉烯酮又稱F-2 毒素，是一種雌激素類霉菌毒素，主要危害動物生殖系統(tǒng)，降低動物的繁殖性能[30]，禾谷鐮孢菌是其主要產毒菌株。嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是禾谷鐮刀菌等糧食病原菌的次級代謝物[31]，能引起腸道病變，改變腸道屏障[32]，產生免疫毒性[33]，危害人和動物的健康。伏馬毒素主要由串珠鐮刀菌和多育鐮刀菌產生的一類有不同多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯水溶性化合物，主要有伏馬毒素B1、B2 和B3 等[34]，具有神經(jīng)毒性、器官毒性、免疫毒性、致癌性等有害作用，嚴重危害人畜健康[35]。有研究表明，霉菌毒素能降低豬的生長性能、免疫功能和繁殖性能[36]。飼料的防霉是保障飼料衛(wèi)生質量安全的重要措施。研究表明天然植物精油能夠抑制霉菌生長。Horváth等[37]以白色念珠菌、近平滑假絲酵母、煙曲霉菌、土曲霉菌、小孢根霉菌、鐮刀菌和傘枝梨頭霉為研究對象，研究肉桂精油、香茅精油、丁香精油、薄荷精油和百里香精油抗酵母和抗霉菌活性，結果表明百里香精油、肉桂精油和丁香精油組合抗真菌活性最強。Suhem 等[38]研究發(fā)現(xiàn)氦-氖激光處理的山蒼子精油對黃曲霉的抑制活性提高80%，能完全抑制自然放置的糙米生長霉菌至少25 d，沒有經(jīng)精油和激光處理的糙米在3 d 內觀察到霉菌污染。Gómez 等[39]研究在不同環(huán)境條件下，牛至精油和肉桂精油及其主要活性成分香荊芥酚和肉桂醛對玉米提取液中黃曲霉毒素的抑制作用，結果表明精油及其主要成分對真菌生長和黃曲霉毒素產生有抑制作用。鄔本成等[40]研究肉桂醛和香芹酚等組成的復合植物精油對青霉、黑曲霉和根霉的抑菌作用，并以添加不同水平植物精油（0、100、200、300 mg/kg）飼料發(fā)生霉變的時間估計精油在飼料防霉方面的功效，結果表明，植物精油能有效抑制青霉菌和黑霉菌的生長，飼料中添加植物精油不能明顯延長其保存時間。本研究結果表明，單一植物精油和復配植物精油均能有效抑制霉菌的生長，極端試驗結果顯示，植物精油添加到顆粒飼料中能不同程度的延長顆粒飼料的保質期。

4 結論

山蒼子精油、肉桂精油和生姜精油等體積復配，能有效抑制主要腸道致病菌、霉菌的生長，按1‰比例添加到顆粒飼料中能延緩發(fā)霉時間，延長顆粒飼料的保質期。