李井春，王碩，李雁冰，王國(guó)鑫，魏國(guó)生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

目前，豬人工授精技術(shù)隨著近些年國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展愈加成熟，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展也愈發(fā)加快了腳步，從而人工授精技術(shù)也相應(yīng)成為家畜生產(chǎn)中主要的繁殖手段，豬人工授精最大的優(yōu)點(diǎn)就是以少量的優(yōu)良公豬的精液能為更多的母豬配種，加速遺傳改良[1]，豬的人工授精的成敗在很大程度上取決于精液的質(zhì)量[2]，隨著人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)的廣泛應(yīng)用，精液保鮮技術(shù)逐步走入大眾的視野，獲得了日漸增多的關(guān)注[3]。精液保存技術(shù)的穩(wěn)固可以使優(yōu)質(zhì)基因的傳播得以促進(jìn)，可以加寬精液地域上的使用，提高精液的利用率以及提升豬品種的改良成效，穩(wěn)定的精液保存技術(shù)也可以控制某些病原體的傳播[4]。精液常溫保存的機(jī)理是通過(guò)減緩或抑制精子新陳代謝的速度，同時(shí)避免精子在體外受損傷，從而延長(zhǎng)豬精子在體外存活的時(shí)間。國(guó)內(nèi)豬精液保存的研究主要分為兩種方式，一種就是豬精液的冷凍保存，另一種就是豬精液的常溫保存。因?yàn)樨i精子自身特有的生理性質(zhì)，經(jīng)過(guò)冷凍的精子在解凍后投入使用后存在存活率低、受胎率不理想的問(wèn)題，而常溫保存操作簡(jiǎn)單方便，便于短期保存[5]，所以常溫下豬精液保存方法的研究也就成為今后豬精液保存的方向。精液常溫保存受多種因數(shù)影響，如稀釋液的pH值、滲透壓、抗氧化性等，這些影響因數(shù)直接或間接的影響精子質(zhì)量以及受胎率，研究表明在一次輸精中有45%左右的精子損失，通過(guò)改進(jìn)稀釋液配方，從而提高精液質(zhì)量進(jìn)而提高受胎率[6-7]。

大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均需在培養(yǎng)液中添加一定量的血清，常用的血清為胎牛血清或小牛血清，因?yàn)檠搴屑に?、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、微量元素等物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)控細(xì)胞生存環(huán)境的穩(wěn)定等方面起到重要作用。胎牛血清（FBS）是一種外觀淺黃色澄清、無(wú)溶血、無(wú)異物稍黏稠液體，F(xiàn)BS取自剖腹產(chǎn)的胎牛。FBS功能包括：FBS含有的蛋白酶抑制劑可使細(xì)胞中胰蛋白酶失活，保護(hù)精子細(xì)胞不受傷害；在溶液中，可起到酸堿緩沖的作用；FBS含有的結(jié)合蛋白能夠識(shí)別維生素類物質(zhì)、脂類物質(zhì)、金屬離子和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)所結(jié)合物質(zhì)的活力[8]。試驗(yàn)選擇Modena稀釋液作為基礎(chǔ)稀釋液，該稀釋液在壓強(qiáng)、滲透液、稀釋液的篩選等實(shí)驗(yàn)中取得良好的效果[9]。試驗(yàn)通過(guò)在Modena稀釋液中添加不同體積分?jǐn)?shù)的滅活和非滅活的FBS，在17℃負(fù)壓環(huán)境下以精子活率、直線速度、側(cè)擺幅度等為檢測(cè)參數(shù)。分析胎牛血清對(duì)豬精液保存效果，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)豬人工授精生產(chǎn)實(shí)踐起到一定指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

滅活胎牛血清、非滅活胎牛血清；Modena稀釋液配方為每1 L溶液中分別準(zhǔn)確稱量藥品含量為：葡萄糖 27.50 g；TRIS 5.65 g；EDTA-2Na 2.6 g；檸檬酸鈉6.9 g；NaHCO31 g；檸檬酸 2.9 g；BSA 4 g（現(xiàn)用現(xiàn)配）；青霉素 0.074 g；鏈霉素 0.05 g。無(wú)特殊說(shuō)明下，藥品成分均購(gòu)自西格瑪公司。

1.2 精液來(lái)源

試驗(yàn)所用樣品豬精液來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場(chǎng)，對(duì)所選擇的公豬要求在3 d內(nèi)未進(jìn)行過(guò)采精活動(dòng)，采集3頭健康長(zhǎng)白種公豬精液，年齡為2～3歲。精液品質(zhì)要求為無(wú)異味、色澤為乳白色、密度在2億以上、精子活力在0.7以上的精液，將3頭合格精液分別取等量體積混合在一起保存。豬采集后盡快從豬場(chǎng)在1～2 h內(nèi)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過(guò)程的保溫工具為泡沫保溫箱，泡沫保溫箱需封閉完好，避免由于溫度下降過(guò)快而引起精子冷應(yīng)激。同時(shí)在運(yùn)輸過(guò)程行車穩(wěn)定，以減少劇烈晃動(dòng)對(duì)豬精子的機(jī)械損傷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豬精液的稀釋

將豬精液運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，需將精液放入經(jīng)過(guò)紫外線滅菌后的無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，精液需在室溫下緩慢穩(wěn)定的平衡降溫30 min。平衡降溫后檢測(cè)豬精子活力，精子活力不低于0.7[10]，則符合實(shí)驗(yàn)要求。原精液稀釋處理方法為，將適量原精液分別裝入離心管中，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)調(diào)節(jié)為1 800 r·min-1，離心時(shí)間調(diào)節(jié)為5 min。通過(guò)精板計(jì)數(shù)法計(jì)算離心后沉降的精液精子密度，將各試驗(yàn)組精子密度均調(diào)節(jié)為1×108個(gè)·mL-1，整個(gè)稀釋過(guò)程要在短時(shí)間內(nèi)完成，減少精子沉積造成損傷的發(fā)生，稀釋處理后各試驗(yàn)組需放置在室溫下待用。

1.3.2 精液保存處理

將各試驗(yàn)組的試管口用鋁紙蓋住，但要與外界氣流相通，將試管緩慢放于負(fù)壓保存瓶中靜立，通過(guò)導(dǎo)管將負(fù)壓保存瓶與真空泵機(jī)鏈接，將負(fù)壓保存瓶?jī)?nèi)負(fù)壓調(diào)整為0.4倍大氣壓強(qiáng)。然后將負(fù)壓瓶置于17℃恒溫箱中保存。每間隔12 h對(duì)精液進(jìn)行一次混勻，且搖勻過(guò)程要緩慢進(jìn)行。

1.3.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測(cè)

試驗(yàn)在保存的各時(shí)間點(diǎn)（1，2，3，4，5 d）各組取出適量樣品，置于37℃加熱板上回溫2～3 min，通過(guò)精子分析儀檢測(cè)各試驗(yàn)組豬精子活率、直線速度、路徑速度、側(cè)擺幅度等質(zhì)量參數(shù)，并記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5組，在Modena基礎(chǔ)稀釋液中分別添加滅活和非滅活的FBS，調(diào)節(jié)體積分?jǐn)?shù)分別為0、5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%的FBS，并對(duì)每組進(jìn)行負(fù)壓處理，在17℃恒溫箱保存。試驗(yàn)設(shè)4次重復(fù)試驗(yàn)。通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀檢測(cè)不同的保存時(shí)間下精子活率、路徑速度，直線速度、側(cè)擺幅度等質(zhì)量參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

將各時(shí)間點(diǎn)的各試驗(yàn)組精子的各質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel進(jìn)行初步匯總，再利用StatView 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同，表示差異顯著P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 胎牛血清對(duì)精子活率的影響

由表1可知，各組隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)豬精子活率不同程度的逐漸下降，在2 d時(shí)滅活10%FBS組豬精子活率與對(duì)照組差異不顯著，與5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組差異顯著（P<0.05）；從4 d起對(duì)照組與5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子活率相比有顯著差異（P<0.05），在4 d時(shí)5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子活率差異不顯著（P>0.05）；在5 d時(shí)10%滅活組豬精子活率顯著0、5%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P<0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間差異不顯著（P>0.05）。

表1 胎牛血清對(duì)精子活率的影響Table 1 The effect of FBS on sperm motility rate

2.2 胎牛血清對(duì)精子路徑速度的影響

由表2可知，各組隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)豬精子路徑速度不同程度的逐漸下降，在1 d時(shí)各組精子路徑速度差異不顯著（P>0.05）；在2 d時(shí)對(duì)照組豬精子路徑速度顯著低于5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P>0.05）；3 d后對(duì)照組與非滅活5%FBS組豬精子路徑速度隨著時(shí)間的增加變化明顯，在4 d時(shí)10%滅活FBS組精子路徑速度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組（P<0.05）；在5 d時(shí)0滅活組精子路徑速度顯著高于0、5%滅活、非滅活 5%、非滅活 10%FBS組（P>0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組精子路徑速度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

表2 胎牛血清對(duì)精子路徑速度的影響Table 2 The effect of FBS on sperm path velocity

2.3 胎牛血清對(duì)精子直線速度的影響

由表3可知，各組隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)豬精子直線速度不同程度的逐漸下降，從1 d起5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子直線速度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在5 d時(shí)10%滅活FBS組與非滅活5%FBS組差異不顯著（P>0.05），10%滅活FBS組與非滅活5%FBS組豬精子直線速度顯著高于滅活5%、非滅活10%FBS組（P<0.05），且5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組精子直線速度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

表3 胎牛血清對(duì)精子直線速度的影響Table 3 The effect of FBS on sperm linear velocity

2.4 胎牛血清對(duì)精子側(cè)擺幅度的影響

由表4可知，各組隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)豬精子側(cè)擺幅度變化緩慢，在1 d時(shí)0、5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05）；在 2～3 d時(shí) 10%滅活 FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活 10%FBS組（P＜0.05）；在4 d時(shí)5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05），且 5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；在5 d時(shí)10%滅活FBS組豬精子側(cè)擺幅度顯著高于0、5%滅活、非滅活5%、非滅活10%FBS組（P＜0.05），且 5%滅活、10%滅活、非滅活5%FBS組之間豬精子側(cè)擺幅度差異不顯著（P＞0.05），5%滅活、10%滅活、非滅活5%FBS組豬精子側(cè)擺幅顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 胎牛血清對(duì)精子側(cè)擺幅度的影響Table 4 The effect of FBS on sperm side swing amplitude

3 討論

試驗(yàn)中，選用的Modena基礎(chǔ)稀釋液對(duì)精子保存效果良好，在鮮精中加入一定比例的稀釋液能夠?yàn)榫觿?chuàng)建出與公豬睪丸內(nèi)相似的滲透壓、pH值、低代謝強(qiáng)度等的存活環(huán)境，可排除對(duì)精子長(zhǎng)期保存利的因素，同時(shí)在17℃負(fù)壓環(huán)境下可有效降低精子的代謝強(qiáng)度，使精子處于半休眠狀態(tài)，從而延長(zhǎng)保存時(shí)間。豬的稀釋液中所含的多種成分對(duì)精液長(zhǎng)期保存非常有利，例如在Modena稀釋液中的緩沖物質(zhì)可維持精液pH的穩(wěn)定，碳酸氫鈉、檸檬酸鈉等添加劑可中和稀釋液中細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，從而維持稀釋液pH的穩(wěn)定[10]。而試驗(yàn)中在稀釋液中分別添加5%滅活、10%滅活、非滅活5%、非滅活10%的FBS，目的在于利用FBS具有抑制胰蛋白酶活性、可起到酸堿緩沖的作用、能夠結(jié)合識(shí)別稀釋液中多種成分等功能，從而弱化豬稀釋液中的有害物質(zhì)對(duì)精子的損傷，減緩由于豬精子代謝、細(xì)菌滋生、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)衰變等引起的pH下降速度過(guò)快的過(guò)程，提高精液的保存時(shí)間以及精液質(zhì)量。

試驗(yàn)結(jié)果表明：在基礎(chǔ)稀釋液中加入10%滅活FBS試驗(yàn)組，精子活率、直線速度、路徑速度、側(cè)擺幅度等指標(biāo)均為最好，維持的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5 d，其他3組試驗(yàn)組綜合評(píng)價(jià)來(lái)看各組間差異不顯著，并都優(yōu)于對(duì)照組。精子活率是一項(xiàng)檢驗(yàn)精液質(zhì)量的常規(guī)指標(biāo)，精子的活率和運(yùn)動(dòng)性與精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性緊密相關(guān)，并且可以對(duì)精子潛在的授精能力作出預(yù)測(cè)[11-12]。精子活力對(duì)配種效率、產(chǎn)仔數(shù)、生產(chǎn)性能等都有很大影響，精子活力對(duì)雄性生育和受精是很重要的，是保證精子在受精過(guò)程中與卵子相遇的重要條件[13-14]，而直線速度和路徑速度是反應(yīng)精子活力的重要指標(biāo)[15]，同時(shí)側(cè)擺幅度的變化可以反應(yīng)出精子超激活程度[16]，精子尾部側(cè)擺幅度越強(qiáng)，其活力越高，受精能力越好[17]。試驗(yàn)中，選擇的精子質(zhì)量參數(shù)都直接或間接的反應(yīng)出在豬稀釋液中添加10%滅活FBS對(duì)豬精液保存的優(yōu)良效果。

FBS的滅活處理方法主要是56℃加熱30 min，滅活物質(zhì)主要為補(bǔ)體、蛋白質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等熱敏感物質(zhì)。研究表明[18]，滅活過(guò)程減弱了FBS對(duì)細(xì)胞的促黏附作用，試驗(yàn)中精液保存效果10%滅活FBS組優(yōu)于10%非滅活FBS組，推測(cè)是FBS提高了精子細(xì)胞的黏附性，從而降低了精子的運(yùn)動(dòng)性能以及細(xì)胞膜的物質(zhì)運(yùn)輸代謝過(guò)程。目前在諸多實(shí)驗(yàn)中對(duì)FBS滅活目的在于剔除補(bǔ)體對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，研究表明補(bǔ)體具有提高細(xì)胞通透性作用，在非滅活試驗(yàn)組中可能補(bǔ)體提高了精子細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致一些有害離子及有毒物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)通透性的提高降低了精子的抗冷應(yīng)激能力，破壞精子細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使精子各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)下降加快。并且未滅活的FBS某些成分能夠結(jié)合、滅活、拮抗或協(xié)同激素和藥物的作用[2]，從而影響精液的保存效果。豬精子隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，由于精子代謝和細(xì)菌滋生稀釋液中的產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS對(duì)豬精子膜的損傷是破壞性的，試驗(yàn)中從第3 d開(kāi)始對(duì)照組豬精子質(zhì)量大幅度下降，而添加FBS的各試驗(yàn)組下降幅度較小，可能是FBS中某種物質(zhì)起到抗氧化的作用。研究表明，在FBS中的微量元素硒具有抑制過(guò)氧化物酶對(duì)細(xì)胞的毒性作用，從而緩解ROS對(duì)精子細(xì)胞膜的損傷。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知對(duì)FBS滅活處理后加入基礎(chǔ)液中是有必要的。

試驗(yàn)精液保存在2 d時(shí)，各組不同程度出現(xiàn)細(xì)菌滋生情況，茆達(dá)干等[19]研究表明，精液被細(xì)菌污染，對(duì)精液影響極大，可在短時(shí)間內(nèi)使精子活力、pH值等大幅度下降。精液中大多數(shù)細(xì)菌為革蘭氏陰性菌，其中產(chǎn)生的脂多糖毒性較大[20]。研究表明[8]，F(xiàn)BS能結(jié)合脂多糖而起解毒作用，并且具有緩沖酸堿度的作用，從而緩解細(xì)菌滋生導(dǎo)致的pH值下降問(wèn)題，同時(shí)FBS中所含的蛋白酶抑制因子可以保護(hù)精子細(xì)胞免受稀釋液中蛋白酶的損傷。除此之外，F(xiàn)BS成分中還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)精液的保存是非常有利的[21]，例如FBS成分中的胰島素能與細(xì)胞膜上受體結(jié)合形成復(fù)合物，具有調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑的作用，加強(qiáng)糖原、蛋白質(zhì)、三酸甘油脂等的合成，同時(shí)認(rèn)為胰島素并非本身起到作用，而可能是結(jié)合某些物質(zhì)或者某些微量元素而發(fā)揮作用。又如FBS成分中的結(jié)合蛋白可結(jié)合培養(yǎng)液中的有毒金屬離子，從而減少有害離子進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量，減弱對(duì)精子細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的破壞，同時(shí)能夠與脂類、激素等因子結(jié)合具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的作用，但FBS在試驗(yàn)中起到的具體作用有哪些方面，需要進(jìn)行更深入的探究。從試驗(yàn)結(jié)果可知，添加FBS的各試驗(yàn)組各項(xiàng)參數(shù)都顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明研究中將FBS的多種功能用于解決豬精液長(zhǎng)期保存中所面臨的諸多問(wèn)題是可行的。同時(shí)實(shí)驗(yàn)采用負(fù)壓處理，模擬公豬睪丸負(fù)壓低氧環(huán)境，可有效降低精液含氧量，減緩精子代謝過(guò)程，再結(jié)合FBS的多種功能，從而完善精液配方，提高精液的保存時(shí)間及其精液質(zhì)量。

4 結(jié)論

試驗(yàn)得出在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的FBS在17℃負(fù)壓環(huán)境下可顯著提高豬精子活率、路徑速度、直線速度、側(cè)擺幅度。其中10%滅活FBS組各項(xiàng)參數(shù)顯著優(yōu)于其他組，添加10%滅活FBS是最有利于豬精子在17℃負(fù)壓環(huán)境下保存的，研究結(jié)果為豬人工授精生產(chǎn)實(shí)踐中精液保存技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。